Stručná historie genového inženýrství

V roce 1980 vyjádřil u příležitosti 10. výročí založení Ústavu Friedricha Mieschera v Basileji slavný biolog a pozdější laureát Nobelovy ceny Sydney Brenner názor, že „pokrok závisí na interakci technik, objevů a nových nápadů, pravděpodobně v tomto pořadí klesající významnosti“. Vývoj v dalších letech mu dal za pravdu. Díky technologickému rozmachu jsme dospěli k mnohem hlubšímu poznání základních biologických principů. Získali jsme nástroje pro velmi přesné úpravy genetického kódu, a dokonce vytváříme nové, syntetické formy života.

Genové inženýrství je souhrnný název pro metody sloužící k manipulaci s genetickým materiálem a k tvorbě nových kombinací DNA, využívaných ke změně dědičné informace v buňce, organismu či v celé populaci.

Abychom něčeho takového byli schopni, musíme umět molekulu DNA rozštěpit a potom opět spojit. K prvnímu úkonu slouží enzymy endonukleázy, o druhý se starají DNA ligázy. Když v roce 1970 Hamilton Smith objevil restrikční endonukleázy typu II, štěpící DNA na přesně definovaných místech (na rozdíl od už dříve známého typu I), znamenalo to pro genové inženýrství významný krok kupředu.

První experiment, během něhož byla pomocí restrikčních endonukleáz a DNA ligáz vytvořena rekombinantní DNA (rDNA) sestávající z dědičné informace dvou různých biologických druhů, provedl americký biochemik Paul Berg v roce 1971. Jeho cílem tehdy bylo vyvinout metodu, která by umožnila vnést nové geny do savčích buněk. Se svými kolegy úspěšně vložil geny fágu lambda a galaktózového operonu E. coli do DNA transformujícího viru SV40. Tým si však brzy uvědomil, že propagace genů ve virovém vektoru nese potenciální rizika spojená s inzerční mutagenezí a nádorovým bujením, a projekt byl přerušen.

První geneticky modifikovaný organismus však vznikl již zanedlouho v jiné laboratoři. V roce 1972 ukázal Stanley Cohen, že inkubace bakterií v roztoku CaCl₂ umožňuje efektivní vnesení plazmidové DNA do těchto mikroorganismů. S Herbertem Boyerem pak Cohen vložil rDNA (plazmid nesoucí gen pro resistenci proti antibiotiku tetracyklinu) do E. coli. Bakterie se dále množila a spolu s ní se replikovala i vnesená rDNA. Tento experiment (1973) položil základ pro dnes již klasickou metodu molekulárního klonování. Jen o rok později vytvořil Rudolf Jaenisch první transgenní zvíře, čehož dosáhl integrací virové DNA do genomu myšího embrya. V této době již bylo zřejmé, že genové inženýrství je mocným nástrojem. A použití každého takového nástroje je potřeba mít řádně pod kontrolou.

Konference v Asilomaru

Iniciativy se chopil Paul Berg a začátkem roku 1975 byla na jeho popud uspořádána konference v kalifornském Asilomaru, zaměřená na technologie rekombinantní DNA a rizika s nimi související.

Shromáždění se kromě vědců zúčastnili také lékaři, právníci, zástupci státních orgánů a novináři. Výsledkem jednání bylo prohlášení, že výzkum by měl pokračovat, avšak vědci by se měli držet konkrétních doporučení a bezpečnostních principů.

Zásady správné laboratorní praxe navržené na konferenci v Asilomaru měly velký význam pro další rozvoj genového inženýrství a představují také důležitý příklad zavedení preventivních opatření v době, kdy vědu čeká řada závažných rozhodnutí. Problémy moderní doby pravděpodobně nevyřeší jedna konference, přesto není na škodu nalézat v historii inspiraci.

Bakterie Mycoplasma mycoides JCVI-syn1.0, první organismus s uměle syntetizovaným genomem. „Narodila se“ v roce 2010.Snímek Oregon Health & Science University

Čtení a kopírování DNA

Pro genetické inženýry představuje dědičný materiál knihovnu uchovávající informace o vývoji a pestrosti života, v níž si mohou číst, učit se z ní – a také do ní přispívat.

Průlom ve čtení (sekvenování) DNA způsobily dvě metody vyvinuté kolem roku 1976. První, navržená Frederickem Sangerem a Alanem Coulsonem, využívá upravené nukleotidy, při jejichž začlenění do nového řetězce DNA se syntéza řetězce zastaví. Získáme tak soubor fragmentů různé délky. Z následné analýzy těchto fragmentů lze odvodit původní sekvenci DNA. Druhá metoda Allana Maxama a Waltera Gilberta je založena na chemické modifikaci bází a následném štěpení řetězce vedle pozměněných nukleotidů. Obě metody umožnily získat sekvenci DNA o délce stovek bází během pouhých několika hodin.

Počátkem osmdesátých let hledal Kary Mullis, zaměstnanec firmy Cetus Corporation, postup umožňující detekci bodových mutací sekvenováním části genomické DNA. Pro tento úkol však bylo nejprve třeba nalézt způsob namnožení určitého úseku dědičné informace, ve které se mohla mutace nacházet. Mullise napadlo, že klíčem k úspěchu může být opakování tepelných cyklů, umožňujících nasednutí dvou primerů na opačných stranách studovaného segmentu DNA, a následný přepis této sekvence pomocí DNA-polymerázy. Navržená metoda, nazvaná polymerázová řetězová reakce (PCR), skutečně fungovala, a ještě ji usnadnilo použití termostabilní polymerázy pocházející z bakterie Thermus aquaticus.

Jestliže jsme dědičný materiál přirovnali ke knihovně, vynález Karyho Mullise představuje něco jako genetický knihtisk. Užitek z objevu PCR měla také firma Cetus, která na prodeji patentových práv společnosti Hoffmann-La Roche vydělala v roce 1991 tři sta milionů dolarů.

Éra genomiky

V dalších letech si pracovníci molekulárněbiologických laboratoří sekvenování DNA i PCR rychle osvojili. Prvním organismem, jehož celý genom byl přečten, se roku 1995 stala bakterie Haemophilus influenzae. K zjištění její dědičné informace byla využita metoda „shotgun“ sekvenování, založená na sekvenaci náhodných fragmentů původní DNA, klonovaných do vhodného plazmidu, a následném sestavení celého genomu na základě vzájemných překryvů. Tento postup byl uplatněn také během Projektu lidského genomu (HGP, z angl. Human genome project), který trval třináct let, stál zhruba 2,7 miliardy dolarů a představuje jeden z největších úspěchů moderní vědy. Snažit se vystihnout význam HGP na několika řádcích by bylo pošetilé, je však vhodné zde alespoň připomenout, že tento rok uplynulo dvacet let od zveřejnění draftu sekvence lidského genomu v článcích publikovaných v časopisech Nature (výsledky HGP) a Science (paralelně probíhající soukromý projekt vedený Craigem Venterem). Na HGP později navázaly další a neméně významné projekty, zaměřené na funkční analýzu genomu (Vesmír 80, 313, 2001/6).