Genom v pohybu

Když James Watson a Francis Crick v roce 1953 popsali dvoušroubovici DNA, položili základ moderní molekulární biologie. Elegantní model dvou komplementárních vláken spojených páry bází se stal ikonou života. Postupně se však ukázalo, že DNA není jen rigidní „žebřík stočený do šroubovice“, ale dynamická molekula, schopná překvapivě rozmanitých prostorových uspořádání.

1. Méně známé typy uspořádání DNA .

Ilustrace Pavel Hošek, Vesmír

Tento jev, označovaný jako konformační polymorfismus DNA, zahrnuje vedle klasické B-DNA i další formy, například A-DNA či levotočivou Z-DNA (Vesmír 102, 220, 2023/4). Ještě dále jdou netradiční struktury vznikající v určitých sekvenčních kontextech: triplexy (trojvláknové DNA) či čtyřvláknové struktury známé jako guaninové kvadruplexy (G4) nebo cytosinové i-motivy (obr. 1).

Právě G-kvadruplexy v posledních letech poutají mimořádnou pozornost (Vesmír 97, 360, 2018/6). Základní podmínkou jejich existence je schopnost báze guaninu vytvářet takzvané G-tetrády. Čtyři guaniny se mohou uspořádat do rovinné struktury stabilizované specifickými vodíkovými vazbami (Hoogsteenovým párováním). Tyto tetrády se skládají na sebe a vytvářejí sloupcovitou strukturu stabilizovanou přítomností kationtů, zejména draslíku (obr. 3). Výsledkem je kompaktní, čtyřvláknová konfigurace, která může vznikat jak v DNA, tak v RNA. Kvadruplexy mohou mít různou topologii: paralelní nebo antiparalelní uspořádání vláken a mohou být tvořeny jedním, dvěma nebo čtyřmi vlákny DNA (obr. 2).

2. Různé topologie kvadruplexů se liší počtem a orientací vláken.

Ilustrace Iva Kejnovská; Pavel Hošek, Vesmír

Regulace na všech úrovních

Sekvence schopné tvořit G-kvadruplexy se v genomech nevyskytují náhodně. Naopak, často se koncentrují v regulačně významných oblastech, zejména v promotorech genů. Zde mohou ovlivňovat vazbu transkripčních faktorů a RNA- nebo DNA‑polymeráz, a tak regulovat zapínání či vypínání genů nebo ovlivňovat replikaci. G4 byly nalezeny například v promotorech genů spojených s buněčným dělením a onkogenezí, což naznačuje jejich význam v kontrole buněčného růstu.

Role G-kvadruplexů je velmi rozmanitá. Podílejí se i na klíčových procesech, jako jsou:

Replikace DNA: struktury G4 mohou zpomalovat postup replikační vidličky, čímž ovlivňují stabilitu genomu.

Transkripce (přepis genetické informace z DNA do RNA): mohou působit jako „přepínače“ genové exprese.

Translace (v RNA-formě): G-kvadruplexy v mRNA mohou regulovat efektivitu proteosyntézy.

Rekombinace: přispívají k reorganizaci genomu a mohou být „hotspoty“ genetických rekombinací.

Struktura chromatinu: ovlivňují vyšší organizaci DNA a její interakce s histony.

Zajímavé je, že motivy G4 se často nacházejí nejen v oblastech před geny, ale také v transpozonech, které možná (díky své mobilitě) roznášejí kvadruplexy po genomech. [1] To podporuje představu, že tyto struktury sehrály roli v evoluci genomu a v jeho regulaci.

V naší laboratoři v Biofyzikálním ústavu AV ČR jsme se zabývali některými funkčními otázkami souvisejícími s kvadruplexy. Prokázali jsme inhibiční vliv kvadruplexů uměle vložených do retrotranspozonu Ty1 na jeho skákání po kvasinkovém genomu, tedy vliv G4 na transpozici. [2] Pěstováním semenáčků kukuřice v přítomnosti inhibitoru tvorby G4 jsme demonstrovali vliv G4 na expresi různých rodin transpozonů, čímž jsme přinesli příklad vlivu G4 na transkripci. [3] Ve spolupráci s americkou laboratoří Kateryny Makove jsme zjistili, že kvadruplexy brzdí nebo zastavují polymeraci DNA při sekvenování třetí generace metodou SMRT (z angl. single-molecule real-time), což byl zase důkaz vlivu G4 na replikaci DNA.[4]

Součástka pro nanotechnologie

Studium G-kvadruplexů vyžaduje specifické experimentální přístupy. Mezi základní metody patří cirkulární dichroismus (CD), který umožňuje detekovat charakteristické spektrální „podpisy“ různých typů struktur G4, a polyakrylamidová gelová elektroforéza (PAGE), jež slouží k analýze jejich velikosti a počtu vláken. Další techniky, jako je NMR spektroskopie či rentgenová krystalografie, poskytují detailní strukturní informace. Existují i metody vizualizace G4 in vivo, tedy v živých buňkách.

3. Guaninová tetráda stabilizovaná draselným kationtem.

Ilustrace Pavel Hošek, Vesmír

Schopnost G-kvadruplexů spontánně se skládat do stabilních a předvídatelných struktur je vedle biologického významu činí atraktivními stavebními prvky pro nanotechnologie pracující s DNA. Experimentálně se využívají při konstrukci nanosenzorů či „nanorobotů“, kteří mohou reagovat na specifické molekulární signály, například přítomnost iontů nebo metabolitů. Takové systémy by v budoucnu mohly najít uplatnění v cílené medicíně, například pro dopravu léčiv přímo do konkrétních buněk.

Sekvencí to nekončí

Objev G-kvadruplexů tak rozšiřuje náš pohled na DNA: z jednoduchého nositele lineární genetické informace se stává multifunkční molekula, jejíž 3D struktura čí konformace je stejně důležitá, ba možná důležitější než samotná sekvence. Na úrovni funkce totiž probíhá přírodní výběr. Dvoušroubovice zůstává symbolem života, ale není jedinou formou DNA. Vedle ní existuje celá galerie alternativních struktur, které jemně ladí fungování genomu, a možná v sobě skrývají klíče k novým biologickým i technologickým objevům. I na úrovni konformace DNA vidíme, že genom je strukturně i funkčně dynamickou entitou.