Neznámá tvář molekul života

Vztah nukleových kyselin a proteinů je podle středoškolských učebnic poměrně prostý. DNA nese dědičnou informaci, RNA je její poslíček a proteiny představují produkt a zároveň výkonnou složku celého systému. Pravidelní čtenáři Vesmíru vědí, že skutečnost je mnohem barvitější. Netriviální podobou a funkcí nukleových kyselin se v Ústavu organické chemie a biochemie zabývá Edward Curtis se svou výzkumnou skupinou.

Žádná molekula nemá tak ikonický tvar jako DNA. Dvoušroubovice popsaná v roce 1953 Jamesem Watsonem a Francisem Crickem (za nemalého přispění Rosalind Franklinové a Maurice Wilkinse) to dotáhla nejen do popularizačních článků a televizních dokumentů pro nejširší veřejnost, ale i do log biotechnologických firem, na potisky triček či do náhrdelníků a náušnic.

Přesto není dvoušroubovice jedinou formou prostorového uspořádání DNA. A nemáme teď na mysli uměle připravené molekuly využitelné jako programovatelné konstrukční prvky v nanotechnologiích. I v buňkách se přirozeně vyskytuje DNA, jejíž nukleotidové řetězce jsou v prostoru uspořádány jinak. Nejedná se přitom o pouhé kuriozity bez praktického významu.

V poslední době hojně studovaným příkladem jsou G-kvadruplexy. Ve středoškolských učebnicích se o nich nedočtete a na tričku jejich obrázek nosí nanejvýš nějaký geek z molekulárněbiologické laboratoře. G v jejich názvu značí guanin – jednu z bází DNA a RNA. Zatímco ve dvoušroubovici se guanin páruje s cytosinem v komplementárním řetězci, v G-kvadruplexech je vodíkovými vazbami spojen se třemi jinými guaniny. Vodíkové vazby v tomto případě propojují jiné části molekul bází než při klasickém párování (tzv. Hoogsteenovo párování). Čtyři guaniny tvoří rovinný útvar připomínající čtverec: G-kvartet. A spojením několika takových kvartetů nad sebou vzniká G-kvadruplex (obr. 1).

Čtyři guaniny propojené vodíkovými vazbami vytvářejí G-kvartet (vlevo). Poskládáním několika takových kvartetů nad sebou vzniká na řetězci DNA nebo RNA trojrozměrný G-kvadruplex (vpravo), který může selektivně vázat různé molekuly a hrát roli v regulaci genové exprese.Ilustrace Edward Curtis

In vitro jsou G-kvadruplexy známy už od šedesátých let minulého století, dlouho však nebylo jasné, zda nejde pouze o umělé artefakty. Jsou přirozenou součástí živých buněk? A plní v nich nějakou funkci?

„Pokud se G-kvadruplexy tvoří tak snadno in vitro, příroda si jistě našla cestu, jak je využít in vivo,“ prohlásil už před více než třiceti lety Aaron Klug, britský krystalograf litevského původu. V roce 1982 získal Nobelovu cenu za vývoj krystalografické metody umožňující odhalit na snímcích z elektronového mikroskopu trojrozměrnou strukturu složitých molekulárních komplexů, například nukleových kyselin a proteinů.

G-kvadruplex může vzniknout i z běžné dvoušroubovice DNA, je-li jeden z řetězců bohatý na guaniny. K tomu je nezbytné, aby se dvoušroubovice rozpletla – děje se to například při replikaci DNA nebo při přepisu dědičné informace z DNA do RNA.Ilustrace Edward Curtis

V té době se ukázalo, že G-kvadruplexy jsou běžné v telomerách na koncích chromozomů. Ale teprve v posledních letech molekulární biologové odhalují, jak hojné v genomech organismů jsou a jaké role v nich plní. „Bioinformatici vytvořili model umožňující předpovědět, které sekvence mohou tvořit G-kvadruplexy. Studie publikované v roce 2005 jich v lidském genomu odhalily téměř 400 000 a pozdější výzkumy ukazují, že jich může být ještě více,“ říká Edward Curtis.¹⁾ A dodává: „To samo o sobě neznamená, že hrají nějakou biologickou roli. Ale zároveň se ukázalo, že v genomu nejsou rozmístěny náhodně. Hojné jsou například v regulačních oblastech. To vedlo k myšlence, že jednou z jejich rolí může být regulace transkripce.“

Dnes už víme, že jsou mimo jiné součástí promotorů (sekvencí DNA, na které se váže enzym RNA polymeráza a zahajuje transkripci, tedy přepis dědičné informace do RNA) velkého množství genů včetně onkogenů. Představují proto potenciální cíl pro terapie snažící se pomocí regulace transkripce bojovat s nádorovým bujením. G-kvadruplexy se tvoří i v molekulách RNA a ovlivňují tvorbu proteinů – například tím, že pomáhají regulovat způsob, jakým se mRNA sestříhá, a tedy i to, jakou sekvenci aminokyselin bude výsledný protein mít.

Jak se stane, že se DNA poskládá do tak zvláštní trojrozměrné struktury? „Ve dvoušroubovici vzniknout nemůže, ale v některých fázích buněčného cyklu se DNA rozplétá a samostatné řetězce se mohou v místech bohatých na guaniny do G-kvadruplexů uspořádat,“ vysvětluje Curtis (obr. 2). Příležitost k tomu je při replikaci DNA předcházející buněčnému dělení nebo v době, kdy se dědičná informace přepisuje do RNA. Zatímco řetězec bohatý na guaniny vytvoří G-kvadruplex, na komplementárním řetězci obsahujícím cytosiny může vzniknout jiná trojrozměrná struktura, takzvaný i-motiv. Důkaz jeho přirozené tvorby in vivo australští vědci publikovali až letos.²⁾ 

Edward A. Curtis, Ph.D. (*1975)
Narodil se v americkém státě New Jersey, ale rodina se záhy přestěhovala do Los Angeles, v němž žil do osmnácti, a považuje ho proto za svůj domov. Na východní pobřeží se vrátil až jako univerzitní student.
Biologické vzdělání získal v letech 1993–1997 na Princetonské univerzitě. Pod vedením Laury Landweberové se zabýval charakterizací genů pro alfa tubulin u nálevníků. Doktorát obdržel na MIT (1998–2006) v laboratoři Davida Bartela. Pomocí metody selekce in vitro pátral po nových typech ribozymů. V roce 2007 nastoupil jako postdok na Harvardovu univerzitu, kde pracoval v oddělení chemie a chemické biologie u Davida Liu. V roce 2014 přešel do Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR (ÚOCHB) v Praze, kde vede juniorskou skupinu zaměřenou na studium funkčních molekul RNA a DNA. Je ženatý, bezdětný.
V dětství s rodinou často cestoval do Evropy. „Tyhle výlety se mi vždy moc líbily a už tehdy jsem cítil, že bych jednou chtěl někde v Evropě žít.“ Prahu ale navštívil poprvé až v roce 2003 a zanechala v něm prý velký dojem. „Američanům se evropská města zkrátka líbí. Jejich starobylost, architektura. Ale i v rámci Evropy je Praha něco mimořádného.“
Přemýšlel, že by do Evropy odešel jako postdok, ale nic pro to tehdy neudělal, a když dostal nabídku z USA, zůstal. Pak se ale začal rozhlížet po pracovišti, v němž by si mohl založit vlastní skupinu. A v té době dostal mimo jiné e-mail s informací, že ÚOCHB takové pozice nabízí. „Udělal jsem impulsivní rozhodnutí. Zavolal jsem ženě: ‚Co bys řekla tomu, kdybychom se odstěhovali do Prahy?‘ A ona neodpověděla ‚hm, pojďme si o tom promluvit o víkendu‘, jak jsem očekával. Místo toho řekla ‚jasně, tak pojeďme‘. Ještě ten den jsem odeslal přihlášku.“
Když se přiblížil vstupní pohovor, začal o tom přemýšlet přece jen důkladněji. Rozhodl se, že se do Prahy vypraví, prohlédne si ústav, promluví s lidmi – a budou-li o něj stát, rozhodne se podle svého pocitu. „A můj dojem byl báječný. Lidé mi sedli jak v osobní, tak v profesní rovině, vybavení prvotřídní, takže jsem neváhal.“
„Jedna z výhod toho, že jsem odjel z USA, je mnohem zajímavější osobní život. Pořád se učím nové věci. O zemi, její kultuře, o Praze. Kdybych teď byl v Americe a potřeboval bych zajít do supermarketu, byla by to nuda. Tady je v tom pokaždé něco nového. Občas mne čeká překvapení, třeba když koupím nějaké jídlo a doma zjistím, že je to něco jiného, než jsem myslel.“Snímek Stanislav Vaněk

Struktura určuje funkci

Edwarda Curtise zajímají neobvyklé podoby jak DNA, tak RNA, se svým týmem na ÚOCHB však zatím studoval G-kvadruplexy pouze u DNA.³⁾ 

Klade si otázku, jak buňka rozlišuje mezi oněmi stovkami tisíc potenciálních G-kvadruplexů v lidském genomu. „Není pravděpodobné, že každý z nich má všechny biologické funkce, které připadají v úvahu. Musí to být tak, že se v tomto ohledu mezi sebou liší a některé z nich zřejmě nemají funkci žádnou.“ Lze si představit, že specifické role jednotlivým kvadruplexům přisuzují sekvence DNA, které je obklopují. Nebo v tom hrají nějakou roli proteiny. „Nyní ale studujeme tu nejjednodušší možnou hypotézu: že specificita vychází z primární sekvence G-kvadruplexu,“ vysvětluje Curtis.

S kolegy vytvořili knihovnu různých variant této struktury, zatím jich mají asi pět set. Testovali je na sérii biochemických aktivit spojených s G-kvadruplexy. Ví se o nich například, že dovedou katalyzovat reakce, které běžně katalyzují proteinové enzymy ze skupiny peroxidáz. Nebo že vážou molekulu GTP, která hraje důležitou roli v buněčné signalizaci.

Curtisův tým tedy testoval různé varianty G-kvadruplexů na peroxidázovou aktivitu a na schopnost vázat GTP. „Ptali jsme se, zda všechny varianty, které vážou GTP, zároveň katalyzují peroxidázové reakce. Pokud ano, znamenalo by to, že primární struktura G- kvadruplexu mu nedokáže zajistit specificitu. Ale zjistili jsme velké rozdíly. Testování jsme pak rozšířili na několik dalších biologických funkcí a výsledky podporují hypotézu, že dosáhnout specificity lze čistě na základě primární struktury.“ Do budoucna plánují vytvořit modely pro jednotlivé aktivity, například pro vazbu GTP. A pak v lidském genomu hledat tento konkrétní typ G-kvadruplexů a zkoumat jejich význam pro organismus.

Od hmyzu k DNA a RNA

Na počátku Curtisova zájmu o přírodní vědy ale nebyly nukleové kyseliny. Ostatně které dítě touží po kariéře molekulárního biologa? Edwarda v dětství fascinoval hmyz. Mezi rodinnými přáteli byl i profesionální entomolog, který ho provázel na prvních krůčcích za poznáním této druhově pestré skupiny organismů.

„Plán stát se entomologem mi vydržel až do vstupu na univerzitu. Ale mezi prvními biologickými kurzy byl i úvod do molekulární biologie. A ten mi otevřel zcela nový svět, který jsem se rozhodl prozkoumat.“ Zvláště ho zaujala problematika prostorového uspořádání proteinů. Jakým způsobem určuje pořadí aminokyselin výsledný tvar proteinové molekuly?

Na Princetonské univerzitě se dostal do laboratoře Laury Landweberové (dnes působí na Kolumbijské univerzitě), která na katedře ekologie a evoluční biologie používala metody molekulární biologie, biochemie a biofyziky. Díky ní se seznámil s technikou selekce in vitro (viz níže), která umožňuje izolaci nových funkčních molekul DNA a RNA. A to se mu zdálo ještě zajímavější než skládání proteinů. Během doktorátu na MIT se už zabýval touto problematikou. Hledal nové druhy ribozymů – molekul RNA s enzymatickou aktivitou. „Takhle jsem se proměnil z kluka, který obrazně řečeno běhá po přírodě se síťkou na motýly, v molekulárního biologa, který dnes působí v ústavu zaměřeném primárně na chemii.“

Hmyz ho stále zajímá, ale nemá na něj čas. „Občas si přeju, aby den měl 48 hodin nebo abych nemusel spát a mohl se paralelně věnovat hmyzu. Ale nejde to,“ říká a z šuplíku vytahuje malou krabičku. V ní uchovává vysušená tělíčka strašilek. „Měl jsem pár mazlíčků, ale i s tím je prozatím konec.“

Strašilky, které má Edward Curtis ve své pracovně, upomínají na jeho původní záměr stát se entomologem.Snímek Stanislav Vaněk

Uvažuje však o jiném „domácím mazlíčkovi“, který má vztah k vědě. Ale ze zcela odlišné větve fylogenetického stromu. Když přišel do České republiky, ptal se jednoho z nových přátel, co rád dělá ve volném čase. Prý chodí na houby. „Přišlo mi to zajímavé. Ve Spojených státech neznám nikoho, kdo by to dělal.“ O několik týdnů později narazil na dalšího houbaře. „Říkal jsem si, jaká je pravděpodobnost, že potkám dva lidi s tak zvláštním koníčkem. Později jsem zjistil, že tady se ta pravděpodobnost rovná jedné. Jeden kolega mne potom vzal na houby a bylo to skvělé.“

To je jedna část příběhu. Druhá spočívá v tom, že jedním z projektů, na nichž Curtisova skupina pracuje, je snaha vytvořit DNA nebo RNA molekuly, které by generovaly nějaký druh signálu, například světelného. Mohly by být užitečné v diagnostice. „Vím, že existují houby s bioluminiscencí, na internetu se dají koupit jako kit. Přemýšlím o nich. Akorát bych si musel dát pozor, aby mi je kolegové nesnědli.“

Šikovné molekuly

Ve vědě je těžké předvídat, zda výzkumný projekt bude fungovat, případně jak rychle bude postupovat vpřed. Když Edward Curtis zakládal juniorskou skupinu na ÚOCHB, počítal s tím, že se bude věnovat především vyhledávání funkčních molekul RNA. Paralelní větev výzkumu zaměřená na G-kvadruplexy v DNA přinesla výsledky v podobě publikací rychleji, ale na molekuly RNA ve skupině nezapomínají. Jsou totiž mimořádně zajímavé.

„Z pohledu evoluční biologie se lze na DNA dívat jako na genotyp a na proteiny jako na fenotyp. DNA představuje informaci, která ale sama o sobě nic nedělá. Naopak proteiny sice mohou katalyzovat pestrou paletu reakcí, ale nedovedou uchovávat informaci. Jak takový systém mohl na počátku života vzniknout? Jednu z možných odpovědí nabízí skutečnost, že RNA může fungovat jako genotyp a fenotyp zároveň.“ Objev ribozymů v roce 1982 proměnil pohled na nukleové kyseliny a vedl k úvahám o „RNA světě“ na počátku života.⁴⁾ Molekuly RNA mohou selektivně vázat různé ligandy a jejich role v organismu i možnosti terapeutického využití jsou obrovské (obr. 3).

RNA senzor vytvořený z ribozymu, který je katalyticky aktivní (ON) pouze v přítomnosti specifického ligandu.Ilustrace Edward Curtis

„Snažíme se navrhnout nové nebo vylepšené molekuly RNA,“ charakterizuje Edward Curtis tuto část výzkumu své skupiny. Typickým požadavkem na takovou molekulu RNA je, aby katalyzovala některou z důležitých biochemických reakcí, nebo aby vázala látku, která je pro organismus důležitá. Může to být nějaká malá molekula, protein, nebo i nějaký ještě složitější komplex.

Teoreticky si lze představit, že si definujeme požadované vlastnosti a podle nich navrhneme takovou sekvenci nukleotidů, aby se RNA složila do tvaru, který tyto vlastnosti zajistí, například vytvoří vazebné místo pro konkrétní molekulu. Ale k tomu máme zatím velmi daleko. Spočítat prostorové uspořádání z primární sekvence se částečně začíná dařit u proteinů, ale u nukleových kyselin to je zatím sci-fi. „Bylo by to úžasné. Rád bych se o tom pobavil s výpočetními chemiky tady v České republice a zkusil bych některé pro tento úkol nadchnout, poskytl bych jim experimentální podporu,“ zasnil se na chvíli Curtis.

Než se takové cílené designování trojrozměrné struktury RNA promění v realitu, musí si vědci poradit jinak. Používají již zmíněnou metodu selekce in vitro (obr. 5), která se inspiruje jedním z mechanismů biologické evoluce.

Princip izolace RNA enzymů (ribozymů) metodou selekce in vitro. Obrovské množství molekul RNA lišících se svou sekvencí (pool, vlevo uprostřed) vystavíme kontaktu s molekulou, kterou mají vázat. Ty, které se nenavázaly, v dalším kroku smyjeme. Zbylé reagující molekuly namnožíme pomocí metody RT‑PCR a celý proces několikrát opakujeme. Postupně tak z původní směsi izolujeme molekuly RNA, které požadovanou molekulu vážou nejsilněji.Ilustrace Edward Curtis

Selekce in vitro

Kdybychom syntetizovali jedinou náhodnou sekvenci RNA, měli bychom extrémně nízkou pravděpodobnost, že bude vykazovat nějakou zajímavou aktivitu. Ale co když jich připravíme a otestujeme tisíc? Nebo milion? Šance, že některá z nich bude umět něco užitečného, poroste.

Technicky je možné připravit až 10¹⁵ různých sekvencí. To je mnohem více, než kolik je potřeba pro náhodný vznik funkční molekuly. Zbývá vyřešit drobný problém: jak v té záplavě molekul najít tu pravou?

„Představte si, že na pláži ztratíte klíče od bytu,“ nabízí přirovnání Edward Curtis. „Jsou pohřbeny někde v písku. Kdybyste všechen písek z pláže prohnali přes nějaký filtr, který odstraní 99 % zrnek, výrazně tím zmenšíte objem pro další hledání, ale stále bude písku příliš mnoho. Takže to uděláte ještě jednou. A ještě jednou… Nakonec získáte malou hromádku písku s klíči.“

Selekce in vitro funguje do jisté míry podobně. Hledáme například molekulu RNA, která váže konkrétní aminokyselinu. Můžeme molekuly této aminokyseliny fyzicky připevnit k podkladu a „nalít“ na ně připravené molekuly RNA s nejrůznější sekvencí nukleotidů. Některé se na aminokyselinu navážou, ostatní smyjeme, a tím je z dalšího výběru odstraníme. S těmi, které se navázaly, můžeme celý proces opakovat a postupně tak získáme ty molekuly RNA, které se na příslušnou aminokyselinu vážou nejefektivněji.

Má to ale ještě jeden háček. „Při každém opakování část hledaného materiálu ztratíte, protože se molekuly RNA například zachytí na stěnách laboratorních nádob. Takže byste o všechny molekuly přišli dříve, než byste mezi nimi našli tu, kterou hledáte.“ Proto po každém cyklu přichází na řadu ještě namnožení (amplifikace) těch molekul RNA, které vymývání „přežily“. U selekce molekul DNA k tomu slouží v molekulárně biologických laboratořích rutinně využívaná metoda PCR (polymerázová řetězová reakce), u RNA se uplatňuje její modifikace RT-PCR, jejíž součástí je přepis (neboli reverzní transkripce) RNA do DNA.

„Když cyklus selekce, reverzní transkripce, amplifikace a zpětné transkripce do RNA zopakujete několikrát, typicky v pěti až deseti krocích, získáte využitelný signál,“ vysvětluje Curtis. Ze zdánlivě nekonečné rozmanitosti se vám podaří vybrat tu molekulu RNA, která plní úkol podle počátečního zadání.

DNA v roli enzymu?

Metoda selekce in vitro se dá použít i na výběr uměle připravených molekul DNA. Zatímco o rozmanitých schopnostech RNA už leckdo slyšel, DNA zůstává v představách většiny z nás stále jen pasivní nositelkou dědičné informace. Ale ukazuje se, že i ona dokáže katalyzovat chemické reakce. Přinejmenším některé umělé molekuly DNA testované in vitro to dovedou. Zda se tak za nějakých okolností děje i přirozeně v buňkách, zůstává zatím záhadou. Známe asi deset typů přirozeně se vyskytujících ribozymů, ostatní byly připraveny uměle. Přírodní DNA enzym neznáme žádný. Buď neexistují, nebo jsme se po nich zatím nedívali dost pozorně.

„Aktivně je nehledáme, ale přemýšlím o tom roky a podle toho, jak se laboratoř bude vyvíjet a jaké lidi tu budu mít, by to mohl být projekt, na který bych se rád zaměřil. Je to riskantní. Když neuspějete, nebude z toho nic, žádná publikace. Ale pokud ano, bude to nesmírně zajímavé,“ nastiňuje Edward Curtis možnou budoucnost své výzkumné skupiny.

Vznik tohoto textu podpořil ÚOCHB AV ČR.