Zatnout tipec nádorům

V Praze vystudovala virologii, odešla do Londýna a udělala si jméno v oblasti výzkumu HIV. Od virů obrátila pozornost k rakovině, osm let působila na MIT u Roberta Weinberga, světové špičky tohoto oboru. Její nápad, který Weinberg na začátku označil za bláznivý, se dostal až do Nature. Nyní ho dále rozvíjí s vlastní výzkumnou skupinou v Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR. A nemá malé cíle. „Nejsem arogantní člověk, ale mám arogantní sny,“ říká o sobě Zuzana Kečkéšová.

Ten nápad je vlastně docela prostý. Ve snaze dostat se rakovině na kobylku všichni zkoumají nádorové buňky, ale proč se nepodívat naopak na buněčné typy, z nichž nádory nevznikají buď vůbec, nebo jen velmi vzácně? Co je chrání?

Společným rysem takových buněk je jejich konečná diferenciace. Nevratně vystoupily z buněčného cyklu a přestaly se dělit, jsou tedy pravým opakem buněk nádorových, které se vymkly kontrole a dělí se, aniž to organismus potřebuje. Typickým příkladem konečně diferencovaných buněk jsou buňky kosterního svalstva nebo neurony (nádory mozku vznikají téměř výhradně z podpůrných buněk gliových).

Ale jaké konkrétní mechanismy udržují tyto buňky v diferencovaném stavu? Kdyby se je podařilo odhalit a pochopit, otevřela by se tím cesta k novým terapiím nádorových onemocnění. Zuzana Kečkéšová se touto cestou vydala. Má na ní za sebou první důležitý krok a ví, kudy pokračovat.

Vraťme se ale do roku 1987. Ve slovenské Galantě navštívíme sedmiletou dívku, kterou hrozně baví záhady všeho druhu…

Trója, pyrit a okna do vesmíru

„Když mi bylo šest, chtěla jsem být vším. Požárníkem, herečkou, klaunem v cirkuse, prostě čímkoli, co jsem ten den viděla. V sedmi mne ale některé věci začaly zajímat více do hloubky,“ vzpomíná Zuzana Kečkéšová. Nejprve jí učarovala archeologie. Maminka jí vyprávěla o Heinrichu Schliemannovi, o Tróji, o vykopávkách… „Přišlo mi, že pohádky opravdu existují. Dlouhá staletí si lidé mysleli, že Trója byla jen bájné město. Pak ho Schliemann našel, pohádka ožila.“

Od archeologie se dostala ke geologii. Tatínek jí koupil geologické kladívko, kterým rozbila všechny kameny v okolí. Při výpravách do hor ji fascinovala „zlatá“ zrnka pyritu, ukrytá v nenápadných tmavých kamenech. Učila se poznávat minerály a horniny, ale po nějakém čase začala zvedat od kamenů hlavu vzhůru k obloze.

„Bylo mi dvanáct, když jsem v knihovně objevila knihu Jiřího Grygara Okna vesmíru dokořán. Hrozně se mi líbil obrázek létajícího Einsteina, četla jsem to s otevřenými ústy.“ Fascinovalo ji, kolik toho o vesmíru stále nevíme. „Milovala jsem záhady, hlavolamy a tajemství. Luštila jsem křížovky a osmisměrky, vymýšlela jsem vlastní a posílala je do časopisů.“ Chodila do astronomických kroužků, účastnila se soutěží, v nichž nikdy nic nevyhrála, ale odradit se nenechala.

Od vesmíru a kosmologie se její zájem přesunul k astrofyzice. Ale tato oblast vědy jí nakonec přišla až příliš abstraktní, složitá – a především se poprvé ozvala motivace, která ji od té doby neopouští: „Neviděla jsem tam přímý potenciál pomoci lidstvu. A já chtěla dělat něco, co by mělo praktický význam, který bych mohla spatřit ještě za svého života.“

A tak se dostala k biologii, konkrétně k virům. Jak je možné, že nejinteligentnější tvor na Zemi nedokáže vzdorovat něčemu tak malému a jednoduchému?

Po střední škole se hlásila na biologii, farmacii a medicínu, dostala se na všechny obory, maminka z ní chtěla mít doktorku. „Ale uvědomila jsem si, že na medicíně by už žádné záhady nebyly. Je to řemeslo. Používáte to, co víte; nebádáte.“ Takže zvolila Přírodovědeckou fakultu Univerzity Karlovy v Praze. Během doktorského studia na londýnské University College se zaměřila na virus HIV. Má několik hojně citovaných publikací, v nichž se mimo jiné věnovala otázce, proč se člověk na rozdíl od jiných primátů nedokáže tomuto viru bránit.¹⁾

Od virů k nádorům

V té době byl vědecký zájem o HIV na vrcholu. Byl to obávaný zabiják, na viru majícím několik málo genů pracovala velká část virologických laboratoří. „Konkurence byla obrovská. Vadilo mi, že jsem neměla čas myšlenky dotahovat do konce. Jakmile jsme na něco přišli, okamžitě se to muselo publikovat, jinak by nás někdo předběhl.“

Čtyři roky postgraduálního studia a badatelské práce plné stresu, od rána do noci zavřená v laboratoři. „Příšerné stravovací návyky, nedostatek spánku, jedním slovem katastrofa. Mladí lidé zvládnou leccos, teď by mne to zabilo. Slíbila jsem si, že už takhle nikdy žít nebudu,“ vzpomíná. Když končila doktorát, retrovirové léky už dokázaly zajistit pacientům prakticky normální délku života, peněz na výzkum ubylo. Cítila, že je na čase změnit pole zájmu a zaměřit se na oblast, která je stejně jako studium HIV prospěšná pro společnost, skýtá možnost dobrých grantů a zároveň je v ní více prostoru pro hlubší ponoření do tématu. Tak se zrodil nápad věnovat se rakovině: souboru více než dvou set nemocí s různými příčinami a průběhem.

Přihlásila se na místo postdoka do tří laboratoří. Do dvou na Harvardu a k Robertu Weinbergovi na MIT. Odborník na metastázy patří k naprosté špičce onkologického výzkumu.²⁾ „Proč bych se nehlásila k nejlepším? Kdyby to nevyšlo, byla jsem připravena zkusit to o stupínek níže. Ale řekla jsem si, že nemám co ztratit. Nejsem arogantní člověk, ale moje sny jsou arogantní.“

Uspěla na všech třech pracovištích, rozhodla se pro Weinberga, s nímž si skvěle porozuměla i lidsky, což měla už brzy plně docenit…

Na MIT získala štědrý grant od americké armády. Mohla z něj zaplatit i doktorandku a laboratorní techničku, takže v rámci Weinbergovy skupiny získala částečnou autonomii. „Bob svým lidem dává peníze na první rok, aby se rozkoukali. Potom si musí sehnat vlastní zdroje, on poskytuje laboratoř, vybavení, konexe, mentoring.“

Paralelně pracovala na dvou projektech. V jednom rozvíjela hlavní výzkumný směr Weinbergovy laboratoře, druhý si mohla zvolit sama. „Jedinou podmínkou bylo slovo ‚cancer‘ v názvu.“

Cesta ze slepé uličky

První z projektů skončil nezdarem. Po třech letech práce bylo jasné, že hypotéza, na které výzkum stál, nebyla správná. Ukázalo se, že geny, o nichž si mysleli, že hrají roli při vzniku metastáz, nic takového nedělají. In vitro vše fungovalo skvěle, ale in vivo vůbec. „Zpětně vidím, že jsem s tím měla seknout už po dvou letech, ale byla jsem tvrdohlavá, nedalo mi to. Pro vědce je velmi důležité poznat okamžik, kdy je rozumné neúspěšné snažení ukončit. Někteří se vzdávají velmi rychle, jiní to nedovedou vůbec a zbytečně marní čas.“

V té době svůj druhý projekt teprve rozjížděla, z něj si optimismus brát nemohla. Přišla na ni krize. „Usoudila jsem, že já sice mám vědu ráda, ale věda nemá ráda mne.“ Jako v mnoha jiných náročných situacích jí pomohla rodina. „Rodiče, sestra i prarodiče mi drží palce, radují se z mých úspěchů a vždy vědí, jak mne povzbudit a rozesmát, když se mi nedaří.“

Oprášila svou dávnou lásku k antice a přihlásila se na Harvard k dennímu studiu historie. Weinberg jí napsal doporučující dopis a souhlasil s tím, že při studiu může rok pracovat po večerech na svých experimentech. A pak se uvidí. Sám se prý v životě několikrát ocitl v podobném rozpoložení. „Vedla jsem dvojí život – přes den na Harvardu studentka s batůžkem, večer postdok na MIT.“ Během toho roku se Zuzaně začalo s druhým projektem dařit a z historie se stal opět jen koníček.

Nápad studovat buněčné typy, z nichž nádory prakticky nevznikají, se Weinbergovi ze začátku vůbec nelíbil. Říkal tomu „whacko project“ (bláznivý, pošetilý). Zuzaně na něm dovolil pracovat, ale nesměla o něm na schůzích skupiny mluvit. Prý: „Počkej s tím, až budeš mít něco velkého.“ A ona si počkala. Když bylo jasné, že je na správné cestě, Weinberg jí poskytl veškerou možnou podporu.

Úsilí, které trvalo šest let, vyvrcholilo článkem v Nature³⁾ a nyní pokračuje v Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR (ÚOCHB).

Prohledávání genetické džungle

Základní myšlenkou onoho „whacko“ nápadu tedy bylo podívat se, čím se na molekulární úrovni liší buňky tkání, které netrpí nádory, od ostatních buněk. Které geny se v nich exprimují více než jinde a udržují je v diferencovaném stavu? Mohl by být některý z nich klíčem k nové terapii?

Prvním krokem při hledání potenciálních tumor supresorových genů bylo porovnání diferencovaných svalových vláken (mnohojaderných útvarů vzniklých splynutím několika buněk) s nediferencovanými svalovými progenitory – buňkami předurčenými diferencovat se ve svalová vlákna, které se však stále ochotně dělí. Protože oba tyto buněčné typy patří k svalové tkáni, dalo se očekávat, že aktivita genů u nich bude velmi podobná, takže dobře vyniknou právě ty rozdíly, které souvisejí s diferenciací a s neschopností dalšího dělení.

Čím více je příslušný gen v buňce aktivní, tím více kopií mRNA jeho transkripcí vzniká. K porovnání míry exprese slouží tzv. DNA čip. Reverzní transkripcí se z mRNA získá komplementární DNA (tzv. cDNA). Molekuly cDNA jsou pak označeny fluorescenční značkou (každý buněčný typ má přiřazenu jinou barvu) a naneseny na miniaturní destičku, která má na definovaných místech ukotveny krátké řetězce DNA se známými sekvencemi. Molekuly cDNA, které na destičce najdou k sobě komplementární řetězce, se s nimi spojí. Po omytí a vybuzení laserem pak fluorescenční značky prozradí, které molekuly cDNA se navázaly, a tedy které jim odpovídající mRNA jsou v jednotlivých typech buněk přítomny.

Takto Zuzana Kečkéšová vytipovala 87 genů, jejichž zvýšenou aktivitou se diferencované svalové buňky liší od svých progenitorů. Z nich vyřadila geny kódující cytoskeletální proteiny, protože se s nimi špatně pracuje. „Když máte na stromě tolik ovoce, začnete trhat od spodních větví. Kdyby to nevedlo k ničemu zajímavému, k cytoskeletu bych se vrátila.“

Ze zbylých 50 genů vybrala 22 nejvhodnějších kandidátů. Vyřadila například geny pro proteiny, které už byly známy jako potenciální tumor supresory. „I když u nich třeba není známo, jak fungují, už se o nich ví. Hledala jsem něco zcela nového.“

Těch zbývajících 22 genů začala studovat detailněji. V Nature s kolegy informovala o genu pro mitochondriální protein LACTB, který přinesl velmi zajímavé výsledky jak in vitro, tak in vivo.

Kladivo na nádory

Molekulárněbiologické metody umožňují opatřit vybrané geny „vypínačem“, jehož „sepnutím“ je lze aktivovat. Zuzana Kečkéšová takto vnesla „dálkově ovládaný“ (prozatím spící) gen pro LACTB do buněk lidského nádoru prsu. Exprese vneseného genu byla řízena promotorem, který lze aktivovat pomocí antibiotika doxycyklin. V experimentu se vzrůst koncentrace proteinu LACTB po „zapnutí“ příslušného genu projevil tím, že ochota buněk k dělení výrazně poklesla.

Následné porovnání výskytu LACTB v buňkách získaných biopsií z nádorů prsu různých pacientek (714 vzorků) s výskytem ve zdravých buňkách prsní tkáně potvrdilo, že v mnoha nádorových buňkách je LACTB ve významně nižší koncentraci.

Zajímavé bylo zjištění, že rozdíly se neprojevily na úrovni mRNA, ale až na úrovni podle ní vytvořených proteinů. „Nad tím jsme se trochu pousmáli. Díky tomu, že v kosterních svalech je LACTB nejhojnější, je v nich regulován jak na proteinové úrovni, tak už na úrovni transkripce z DNA do mRNA. Kdybych se na začátku nepodívala do kosterního svalu, ale do jiných buněk lidského těla, LACTB bych zřejmě nenašla.“

Snížená koncentrace LACTB byla patrná u 34 až 42 % vzorků buněk z nádorů prsu, zbytek rakovinných buněk ale LACTB obsahoval. Zkrátka občas v nich LACTB bylo málo, občas se od zdravých buněk nelišily. Jak to interpretovat?

„Tento typ studií má své limity. V mikroskopu vidíme LACTB, ale nepoznáme, zda je aktivní a zda je v buňce na tom místě, kde může plnit svou funkci.“ Výsledky studie proto mohou skutečnou efektivitu tohoto tumor supresoru podceňovat. Detailnější výzkum umožňující určit aktivitu proteinu a jeho přesnou lokalizaci v buňce by možná přinesl zjištění, že aktivní forma proteinu ve skutečnosti chybí u 60 nebo 70 % nádorů prsu. I tak je ale pravděpodobné, že část buněk má LACTB dostatek, a přesto je to před nádorovým bujením neochránilo. „V biologii nic nefunguje na 100 %,“ dodává Zuzana Kečkéšová.

Následovaly pokusy na myších, které injekčně dostaly nepěkný dárek v podobě buněk lidského nádoru prsu. A v buňkách opět tiše spal gen pro LACTB. Když nádory dorostly do průměru 10 mm, myšky obdržely v pití dávku doxycyklinu, který gen probudil. Za dva až tři týdny se nádory viditelně zmenšily, za čtyři týdny některé z nich zcela zmizely. LACTB fungoval jako tumor supresor in vivo.

Pokusy na myších, byť s vnesenými lidskými buňkami, však mají svá omezení. Rakovinné buňky vždy působí v kontextu okolní tkáně. Komunikují s fibroblasty, mezenchymálními buňkami a dalšími buněčnými typy. V myších jsou sice nádorové buňky lidské, ale ostatní buňky, které růst nádoru podporují, patří myši. A to může ovlivnit například působení léku.

Dnes jsou už k dispozici nové modely, tzv. patient-derived xenografts, tedy tkáňové štěpy odebrané lidskému pacientovi a vložené do jiného organismu. V tomto případě část nádoru prsu vnesená do myši. Nádor v myším těle obsahuje nejen lidské nádorové buňky, ale i další lidské buněčné typy. Více tedy odpovídá skutečnému lidskému nádoru. „Pokud se dostaneme k tomu, že budeme zkoušet potenciální terapeutika, rozhodně to budeme dělat na patient-derived xenografts modelech,“ říká Zuzana Kečkéšová.

Zpátky v Evropě

Po osmi letech na MIT cítila, že už má dost zkušeností na to, aby mohla vést vlastní výzkumnou skupinu. A tak se začala rozhlížet po možnostech. Měla nabídky z New Yorku a z Yaleovy univerzity, s mužem je to ale táhlo do Evropy. „Můj muž je Švéd, v Americe jsme byli od příbuzných dost izolovaní, naše děti znaly širší rodinu jen přes Skype, už to začínalo být smutné.“

Zvažovali Prahu a Barcelonu, Praha nakonec zvítězila. „Je to moje kultura, studovala jsem tu, mám tu kamarády.“ A k rodině na Slovensku to je kousek. Zuzana se zajímala i o Ústav molekulární genetiky, nakonec však zakotvila v ÚOCHB. Ústav navzdory chemii ve svém názvu rozvíjí i biologický a biomedicínský výzkum a molekulární bioložka zkoumající nádory do jeho portfolia bez problémů zapadá. „Velmi se mi tu líbí snaha dotáhnout výzkum až ke komercializaci. To dělá málokterý ústav nejen v ČR, ale v celé Evropě. A já rozhodně chci projít celou cestu. Ve spolupráci s chemiky vyvinout účinnou látku, která by se dala klinicky využít.“

Nastoupila nejprve do laboratoře biochemika Jana Konvalinky, od loňského října má vlastní juniorskou skupinu. Získala prestižní EMBO grant a další grant od GA ČR. Vědu však zatím podle vlastních slov dělá asi na dvacet procent, protože česká legislativa činí ze zařízení nové laboratoře časově a byrokraticky náročnou bojovku. „Když v Americe seženete peníze, vybavení laborky vám trvá dva měsíce. Jste omezeni jen rychlostí, jakou jsou firmy schopny přístroje doručit. Tady musím vypsat zakázku a čekat. Peníze mám, prostory mám, dychtivost mám, vím, co potřebuji, ale nemohu se k tomu dostat.“ Vybavit laboratoř zabere nejméně rok.

Prozatím využívá zázemí skupiny Jana Konvalinky, nové experimenty na myších nedávno odjela udělat na MIT. „Je to trochu absurdní. Působím v ČR, ale kvůli byrokracii musím za pokusy do USA.“

Na ÚOCHB se chce nadále věnovat proteinu LACTB, kolem kterého je stále mnoho otazníků. Je to enzym, ale neznáme jeho substrát. Pokud se ho podaří odhalit, potenciální terapie by se mohla obejít i bez LACTB. Nevíme, jak rakovinné buňky tento protein inaktivují, neznáme ani signální dráhy přenášející informaci o aktivaci LACTB do buněčného jádra.

Zbývá také prozkoumat další geny, které stejně jako gen pro LACTB ze screeningu vyšly jako potenciální tumor supresory. „Mám čtyři nebo pět kandidátů, u nichž jsme už ověřili, že dovedou zabíjet nádory in vivo.“

Pokud vše dobře dopadne (jednání by měla být dokončena po uzávěrce tohoto čísla), získá Zuzana Kečkéšová na svůj výzkum vedle grantů i štědrý příspěvek od skupiny českých investorů. V případě patentovaného terapeutického využití budou mít podíl na zisku, ale i kdyby to k patentu nedospělo, investice litovat nebudou, protože chápou obecný význam nových poznatků o fungování lidského těla. Taková podpora základního výzkumu soukromým kapitálem je v českých (i evropských) poměrech zatím dosti neobvyklý počin.

A co virologie, patří už v Zuzanině životě nenávratně minulosti? „Viry některé typy rakoviny vyvolávají. Také se může ukázat, že některý z námi zkoumaných genů má nějakou roli v imunitě vůči virům. V blízké budoucnosti na tom dělat nebudeme, ale propojení obou oborů se nabízí. Hodně by mne to bavilo.“ Nechme se překvapit.

Vznik tohoto textu podpořil ÚOCHB AV ČR.