Molekuly na povel II.

Jan Amos Komenský a možná ještě i Johann Wolfgang Goethe měli to obrovské štěstí, že žili v době, kdy mohli porozumět fungování většiny strojů a přístrojů, jakož i principu používaných pracovních postupů. My naopak žijeme obklopeni spoustou převážně černých a šedivých beden, v jejichž nitru se dějí nepochopitelné věci, a používáme výrobky získané naprosto nejasnými cestami. Když ležel Ignác z Loyoly smrtelně raněn na lůžku, věděl, že buď zemře, nebo přežije, a jednoduché léčení pouštěním žilou či přikládáním náčinků na to nemuselo mít žádný vliv. Lidé tehdy světu kolem sebe rozuměli, a čemu nerozuměli, to bylo v rukou božích. Dnes v nemocnici z několika kapek nejrůznějších tělních tekutin o vás zjistí úžasné informace. Vám to sice nic neřekne, ale spoléháte se, že z toho nějaký odborník vyčte něco důležitého.

Molekulární biologie je také jeden z oborů, který se vymkl z kontroly porozumění daňového poplatníka. Zkusme se ale přece jenom podívat do tyglíků a baněk moderní laboratoře. Třeba se ukáže, že to zas taková hrůza není.

Vyrobte si sondu

Představte si, že máte izolovanou čistou DNA z buněk klokana. Máte jí hodně, máte dost peněz i času, vhodnou náladu, všechny potřebné přístroje i chemikálie, a chcete zjistit, jestli se v této DNA nachází gen pro skákání buší stejný jako v DNA tarbíka (pevně doufám, že žádný takový gen neexistuje). Pořadí nukleotidů genu Sbuš (skákání buší) u tarbíka znáte a celý ten gen máte v ledničce v dostatečném množství (přesněji: ve zkumavce máte několik zcela čirých mikrolitrů destilované vody, v níž snad plavou miliardy molekul). Pokud je gen Sbuš u klokana stejný jako u tarbíka, musí být jednořetězce těchto genů k sobě komplementární, musí spolu vytvářet hybridní tarbíkoklokaní dvouřetězec! Přítomnost genu Sbuš u klokana potvrdíme tedy tak, že prokážeme schopnost nějakého úseku klokaní DNA párovat se s DNA genu Sbuš od tarbíka. Jak prosté.

Prvním krokem je příprava sondy, tedy kousku DNA, který nám komplementární molekulu vyhledá a označkuje. Sonda bude v našem hypotetickém případě vytvořena z DNA genu Sbuš u tarbíka. Tuto DNA ale samozřejmě vůbec nevidíme, tak jako v molekulární biologii nevidíme nikdy nic, s čím pracujeme. Proto ji musíme nějak označit, musíme ji, řečeno publicistickou hantýrkou, zviditelnit. To se nejčastěji dělá dvěma způsoby:

• Do molekuly DNA vložíme radioaktivní nukleotidy.
• Do molekuly DNA vložíme nukleotidy spojené s nějakou velkou, nápadnou molekulou, dobře rozeznávanou specifickými protilátkami. V dnešní době se k tomu velmi často používají nukleotidy s navázaným digoxygeninem, což je látka získaná z náprstníku (Digitalis).

Takto označenou DNA už umíme rozeznat. Radioaktivní sonda pochopitelně vyzařuje radioaktivní záření, které zachytíme na citlivý film (stejný jako na rentgenované kosti). Sonda značená digoxygeninem se zviditelňuje složitěji (ale zase nás neozařuje) – nejdříve ji necháme reagovat s protilátkou, a poté přidáme nějakou bezbarvou látku, kterou enzym napojený na protilátku změní na barvičku (obrázek). Jak říkám, je to trochu složitější, ale není třeba si s tím lámat hlavu. Prostě umíme zařídit, abychom i takovouto sondu „uviděli“.

Hledáme molekulu!

Vlastní hledání v genomu obvykle neprobíhá v roztoku, ale na nějakém nosiči. Jednořetězcovou DNA, v níž budeme hledat, přeneseme a uchytíme na nosič, např. na nylonovou membránu. Je velice důležité, aby byla jednořetězcová – chceme přece, aby vytvářela hybridní dvouřetězce se sondou, kterou jsme dodali (mimochodem, podle toho se celému procesu říká hybridizace). Kdyby prohledávaná DNA byla od začátku dvouřetězcová, s žádnou jinou molekulou by se nemohla párovat, protože všechny ručičky jejích nukleotidů by se už někde držely! K jednořetězcové prohledáváné DNA uchycené na nosiči přidáme sondu, která musí být také jednořetězcová. Proto sondu před přidáním k membráně 10 minut vaříme úplně stejně jako např. vajíčka před přidáním do bramborového salátu. Membránu se sondou vystavíme – a teď pozor – relativně vysoké teplotě. Používáme takovou teplotu, aby se spojení vytvořilo jenom tehdy, pokud jsou řetězce zcela komplementární. Kdybychom nechali vzorky při nízké teplotě, mohla by se naše sonda zachytit i v místě, kde by nepasovala úplně dokonale (a), nebo třeba v místě, kde by sice pasovala skvěle, ale jenom na malém kousku (b).

Proto obvykle celý proces probíhá při 65 – 68 ^oC, pokud očekáváme naprostou komplementaritu, a při cca 50 – 55 ^oC, pokud si myslíme, že kousky DNA se přece jenom budou trochu lišit. Nachytávání sondy na membránu probíhá většinou přes noc, protože chceme mít naprostou jistotu, že se všechny molekuly s příslušným pořadím nukleotidů označily. Potom se ovšem musíme zbavit všech molekul nenavázané sondy. Proto membránu několikrát promýváme v řadě roztoků s přísně hlídaným složením a pH. Po dokonalém odmytí pak sondu zviditelníme – provedeme detekci. No, a když na citlivém filmu uvidíme černý flek (obrázek), tak tam námi hledaná DNA je. A když ho neuvidíme, tak tam buď není, nebo jsme někde v postupu udělali chybu – a můžeme začít znovu.

Sláva hybridizaci

Metodu hybridizace lze využít pro řadu experimentů. Uvedli jsme si příklad, kdy v dosud neprobádané DNA hledáme nějaký gen známý z jiného organizmu. Tak byla objevena spousta genů – jakmile badatelé najdou nějaký gen u myši, hned se podívají, jestli náhodou není také u člověka. Kromě toho podle míry komplementarity, tedy podle teploty, při níž spolu dva řetězce vytvoří dvouřetězec, lze poznat, jak moc jsou si dva kousky DNA z dvou různých organizmů podobné. A tak metodu hybridizace používají nejrůznější odborníci k určování příbuznosti až totožnosti druhů (evoluční biologové) nebo k určování příbuznosti až totožnosti jedinců (kromě ekologů a systematiků i forenzní genetici, to jest ti, co vám mohou přišít otcovství nebo taky vraždu).

Pomocí hybridizace můžeme najít jakýkoliv gen kdekoliv. Vzpomeňte si na příklad z minulého dílu – vyráběli jsme bakterii, která produkovala ve velkém lidský inzulin. Dříve, než se pro takovou bakterii postaví celá továrna, je třeba ověřit, zda v ní příslušný gen skutečně sídlí. To zjistíme tak, že v DNA bakterie specifickou sondou vyhledáme gen, který výrobu inzulinu zajišťuje. Bakterie samy takový kousek DNA nemají, takže pokud získáme na filmu černý flek, je jasné, že se přenos genu zdařil.

Metoda hybridizace nukleových kyselin však zdaleka neslouží jenom k vyhledávání určitého úseku DNA. Lze ji použít například jako metodu k určení relativní míry podobnosti dvou různých DNA. To se dělá tak, že se vezme DNA dvou různých organizmů a po denaturaci, tedy v jednořetězcové podobě, se smísí. Úseky DNA, které jsou komplementární, vytvoří hybridní dvouřetězce. Když pak změříme, kolik molekul zůstalo v jednořetězcové podobě (protože byly odlišné), získáme představu o relativní podobnosti našich dvou testovaných organizmů. Když to provedeme s obrovským množstvím dvojic a statisticky zhodnotíme, můžeme získat fylogenetický strom testovaných organizmů. Tak byl mimo jiné vytvořen v současnosti používaný systém ptáků (Vesmír 75, 692, 1996/12).

Hybridizovat lze nejen DNA, ale i RNA. Postup je v podstatě identický, jenom se kolem toho ještě více navyvádí. RNA je totiž (to už taky víte) poměrně nestabilní a stává se snadnou obětí enzymů. Proto s ní musíme pracovat velmi opatrně, abychom nepřátelům RNA nedali ani tu nejmenší šanci. Pokud tuto zásadu nedodržujeme, může být nepřítomnost signálu jenom důkazem naší špinavé práce, a nikoliv objevem zásadního charakteru.

To vše jsou jenom stručné ukázky možností využití techniky hybridizace nukleových kyselin. Stejně jako štěpení a spojování patří i hybridizace k základnímu arzenálu každé molekulárněbiologické laboratoře. Navíc na přelomu 80. a 90. let podnikla vítězné tažení do pracoven systematických zoologů a botaniků, kde však většinou zanechala jenom zmatek. Brzy ji totiž vytlačila jiná, mnohem snáze interpretovatelná a jednodušší metoda, o níž si povíme zas někdy příště. ¹⁾