Aktuální číslo:

2017/12

Téma měsíce:

Kontakty

Nepolapitelné chloridové kanály dopadeny

Případ mločích vajíček
 |  11. 3. 2010
 |  Vesmír 89, 188, 2010/3

Kdybychom se zeptali náhodných chodců, co je to membránový iontový kanál, oslovený si vybaví třebas filtr na tvrdou vodu v kuchyni nebo tlakovou pumpičku, kterou používají na záchranném člunu k filtrování mořské vody dnešní trosečníci. Někdo si možná vzpomeneme na svého známého se špatnými ledvinami, který chodí na dialýzu krve. Zoologicky vzdělaní pak uvedou různou jedovatou žoužel jako hady, pavouky (černou vdovu),1) štíry, mořské ježíky, čtyřzubce (fugu)2) či mlže homolice,3) kteří zůstávají naživu díky tomu, že u svých obětí blokují membránové iontové kanály pro ionty sodné, draselné a vápenaté. Nebo má oslovený v rodině dokonce nemocného s cystickou fibrózou (viz Vesmír 75, 365, 1996/7) a ví, že tato obtížně zvládnutelná nemoc trápí nezanedbatelné procento obyvatel, kterým chybí v epitelech kanály pro další ionty, tentokrát chloridové. To vede k vysychání sliznic, protože u zdravých osob se spolu s chloridy do dýchacích cest a jiných tělesných kanálků přenáší voda a správně je zvlhčuje. Podobným syndromem, především úporným kašlem a sexuální i jinou „kanálkovou“ dysfunkcí, na sebe mohou upozornit i úporní kuřáci (viz Vesmír 85, 263, 2006/5).

Chloridové kanály řízené vápníkem

A právě na chloridové kanály jako by se v přírodě trochu zapomnělo, nemáme žádný pěkný, pro ně specifický toxin, který by je blokoval nebo je označil pro izolaci a chemickou analýzu. Snad z nouze by připadala v úvahu skupina chemikálií z rodiny stilbenů, ale ty jsou dost málo specifické. Přitom bychom nějakou metodu pro studium chloridových kanálků potřebovali, protože se podílejí na mnoha základních fyziologických procesech, jako je klidový membránový potenciál buněk. Také chloridové ionty tečou na povel gama-aminomáselné kyseliny do neuronů na tlumivých synapsích (což můžeme dále zesílit anxiolytikem diazepamem, a tím můžeme potlačit úzkost).

Kdysi jsme jako jedni z prvních registrovali chloridový kanál z neuroblastomových buněk metodou terčíkového zámku. Od té doby se rodina chloridových kanálů utěšeně rozrostla. Zvláštní pozornost si vydobyl jeden typ, který se snáze otevírá při zvýšení volného (ionizovaného) vápníku uvnitř buněk. Je fyziologicky velmi významný. Tyto vápníkem řízené chloridové kanály4) podmiňují například dobrou sekreci chloridů a vody ve výstelkových epitelech, účastní se činnosti hladkých svalů, smyslových orgánů, elektrických reakcí řas a jiných rostlin. Bez tohoto typu chloridových kanálů bychom vůbec nevznikli, otevírají se totiž pro chloridy v okamžiku úspěšného vniknutí první spermie do vajíčka. Záporné chloridy uvnitř vajíčka zvyšují membránový potenciál a ten se stane nepřekonatelnou překážkou, která zabrání průniku dalších desítek či stovek spermií, čímž zamezí poškození vaječné buňky.

Onemocnění a poruchy kanálů

Tato nepřekonatelná překážka je ale také příčinou hned několika „kanálopatií“ (channelopathies). Patří k nim již zmíněná cystická fibróza, některá kostní onemocnění nebo vrozená oční choroba Bestova vitelliformní makulární dystrofie, která je charakteristická poruchou bílkoviny bestrofinu. To už víme, ale zbývá mnoho otázek. Je tento vápníkem aktivovaný typ chloridového kanálu něčím novým, nebo je to jeden z řady těch, které již byly popsány na jiných epitelových buňkách? Nízký vápník ho aktivuje, vysoký je bez účinku. Proč? Co se děje s jeho vápníkovým senzorem, která část molekuly bestrofinu je při této poruše sítnice oka pozměněná?

Protože různé chloridové kanály jsou prakticky všude, není problém změřit mikroelektrodami jejich elektrické charakteristiky pro určitou buňku. Takovým „otiskem prstu“ iontového kanálu (viz obr.) je vodivost nebo aniontová selektivita, citlivost na vápník a na membránové napětí. Neobyčejně obtížné je ale z nějakého buněčného zdroje získat ten protein dostatečně čistý, aby se dal použít pro studium jeho primární, sekundární, terciární i kvartérní struktury (krystalograficky), pro určení funkčně významných úseků podjednotek kanálu, jejich kritických oblastí a vazebných míst či řady jiných molekulárních vlastností, jež podmiňují správnou, nebo naopak porušenou funkci chloridového kanálu řízeného vápníkem.

Kdo tady dává povely?

V mnoha případech můžeme pro získání mikrogramových či vyšších množství určité bílkoviny použít expresní klonování. Do vhodných buněk – často se používají oocyty africké laboratorní žáby drápatky5) – injikujeme mikropipetou informační nukleovou kyselinu: mediátorovou RNA. Ta může zpočátku nést povely pro řadu bílkovin, mezi nimi i pro hledaný iontový kanál. Jestli se vytvořil a (spolu s desítkami dalších proteinů) zabudoval do membrány,6) to zjistíme za pár dní buď v elektrofyziologickém pokusu mikroelektrodou, která odhalí jeho „otisk prstu“,7) nebo fluorescenční barvičkou. Pak se mediátorová RNA okrajuje a zkracuje, až nakonec zůstane pro expresi sotva pár desítek či stovek nukleotidů, kódujících jen ten jeden kanál.8) Zjistí se v mRNA pořadí nukleotidů, a z něho se určí primární pořadí aminokyselin v kanálové podjednotce. Srovnáním zjištěné primární struktury se známými proteiny pak uvažujeme o sekundární struktuře,9) terciární struktuře10) i struktuře kvartérní. Co je důležité, odhadnou se také ty úseky podjednotek, které procházejí membránou, a ty oblasti, které vytvářejí vlastní iontový kanál nebo nesou regulační místa,11) popřípadě oblasti, jež mohou obsadit různé drogy a toxiny. Odhad se pak potvrzuje, nebo naopak vyvrací cílenými mutacemi, kdy v podezřelém řetězci proteinu nahrazujeme aminokyseliny jednoho typu za jiné.12) Příslušný gen je možné pomnožit (například pomocí PCR) a v nějaké vhodné populaci buněk, jako jsou bakterie, kvasinky, epitelové buňky aj., namnožit takové množství proteinu, že ho lze krystalizovat a difrakcí rentgenových paprsků určit, jak asi náš nový krasavec vypadá v trojrozměrném, počítačově vybarveném zobrazení.

Co zjistili manželé Janovi

Vraťme se ale k chloridovým kanálům. Manželé Lilly a Yuh Nung Janovi z Lékařského ústavu Howarda Hughese v San Francisku, kteří se zabývají výzkumem draslíkových a chemicky řízených kanálů,13) zjistili, že pro expresní klonování chloridových kanálů řízených vápníkem se ona jinak užitečná vajíčka žáby drápatky vůbec nehodí, protože už mají v membráně své vlastní chloridové kanálky, bránící zřejmě oplodnění mnoha spermiemi. Injikování mediátorové RNA, která je podezřelá z toho, že nese gen a povel pro expresi chloridových kanálů řízených vápníkem, by proto asi nejspíš nepřineslo nic nového. Manželé Janovi si ale v literatuře všimli jedné zajímavosti. Polyspermie byla popsána jako docela běžný jev u některých mloků. To by mohlo znamenat, že v mločích vajíčkách možná nejsou ty ochranné chloridové kanály, které by se otevíraly po vstupu první spermie a vedly k uvolnění vápníku z nitrobuněčných zásob. Proč tedy nevyužít pro klonování Ca+2 nějakého mloka? Naštěstí se laboratorně chová a používá axolotl mexický.14) To je ten slavný mlok, kterého už ve dvacátých letech minulého století studoval český profesor Vilém Laufberger. Zjistil tehdy, že když ho krmí štítnou žlázou obsahující tyroxin, může se z larválního stadia, v němž mlok běžně žije a rozmnožuje se,15) změnit v dospělce. A tak si manželé Janovi opatřili axolotly, podáním hormonu je přinutili snést nezralá vajíčka, a pak začali studovat jejich kanálovou výbavu. A ejhle, oocyty sice měly protonové kanály (také nutné pro oplodnění), ale žádné kanály chloridové! Když do nich injikovali komplexní mediátorovou RNA z drápatky, objevily se v nich ohromné nanoampérové proudy Cl záhy poté, co v mločích vajíčkách povzbudili uvolnění Ca2+ z nitrobuněčných zásob.16) Po náležitém „ořezání“ mRNA našli klon, který také produkoval chloridové proudy v přítomnosti vápníku. Zjistili, že takto získaná mRNA je šifrou proteinu o 979 aminokyselinách s předpokládanou molekulovou hmotností 113 kDa. Hledání v již existujících databázích ukázalo, že jde o drápatkový ekvivalent (ortholog17)) lidské a myší bílkoviny TMEM16A, člena rodiny M16 chloridových kanálů otvíraných elektrickým napětím a vápníkem. Mají 6 až 8 transmembránových segmentů a vyskytují se napříč celou říší eukaryot – od nálevníků a kvasinek až po člověka. Sekvence genu byla ihned umístěna do databáze GenBank s přístupovým číslem EU367938.18)

Odchycený gen znamená příležitost

S tímto genem v ruce mají teď vědci příležitost připravit potřebná množství přesně definovaných chloridových kanálů a testovat na nich nové léky proti řadě chorob ovlivněných nebo způsobených poškozenými chloridovými kanály. Jde nejen o zmíněnou cystickou fibrózu, ale také o astma, chronickou bronchitidu, vysoký krevní tlak, a možná dokonce i o některé agresivní druhy rakoviny s dosud špatnou prognózou léčení.

Tento případ mločích vajíček a chloridového kanálu je pěknou ukázkou vtipného uplatnění Kroghova principu na buněčné a molekulární úrovni. Dánský fyziolog cévních kapilár a nobelista August Krogh v dvacátých letech totiž vytyčil zásadu, že je třeba hledat pro každý problém ten nejvhodnější experimentální objekt. Manželé Janovi a jejich studenti tento objekt – mločí vajíčka – s úspěchem nalezli.

Tento výzkum byl podpořen granty IAA500110905 a AV0Z 0110509

Poznámky

1) Rod Latrodectus.

2) Tetrodon.

3) Rod Conus.

4) Calcium-activated chloride channels, CaCCs.

5) Xenopus.

6) Tzn. exprimoval.

7) Vodivost, dobu otevření, citlivost na napětí či na intracelulární zvýšení Ca2+.

8) Pod pojmem genová exprese rozumíme mj. u strukturního genu (kódujícího protein) vyjádření jeho genetické informace v primární struktuře mRNA, v experimentálním prověření funkce vytvořeného polypeptidu (proteinu) a v regulaci funkce proteinu i jeho eventuální degradaci, popřípadě také určení místa působení proteinu v buňce. U iontových kanálů jde nejčastěji o buněčnou membránu.

9) To znamená, které úseky jsou alfa-helixem a které vlásenkou, beta-skládaným lístkem.

10) Jaké jsou možnosti vodíkových a S-S můstků, které propojují kličky proteinu.

11) Napěťový senzor, Ca2+ – vázající místa apod.

12) Například záporný glutamát za neutrální glutamin nebo pozitivní arginin. Viz též Lindovský J., Kaniaková M., Svobodová L., Vyskočil F., Krůšek J., Biochim. Biophys. Acta 1778, 864–871, 2008/4.

13) Viz např. mutace „Shaker“ u octomilky (drozofily) aj.

14) Ambystoma Mexicana.

15) Jev zvaný neotenie.

16) K povzbuzení použili IP3, tj. inositol-3-fosfát, uvolňující se v různých buňkách působením fosfolipázy C z membránových fosfolipidů. IP3 stimuluje výlev vápníku z endoplazmatického retikula a lze ho vpravit do oocytů v neúčinné formě (caged IP3) a pak ho aktivovat světlem.

17) Orthology jsou geny různých druhů s podobnou či téměř identickou funkcí a nepatrnými rozdíly v pořadí bází. Identifikace orthologů je důležitá pro spolehlivou předpověď funkce genu v nově sekvenovaném genomu.

18) Schroeder B. C., Cheng T., Jan Y. N., Jan L. Y., Cell. 134, 1019–1029, 2008/6.

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Molekulární biologie

O autorovi

František Vyskočil

Prof. RNDr. František Vyskočil, DrSc., (*1941) vystudoval Přírodovědeckou fakultu UK v Praze. Ve Fyziologickém ústavu AV ČR, v. v. i., se zabývá neurofyziologií a biofyzikou buněčných membrán. Objevil nekvantové uvolňování neuropřenašečů na synapsích savců. Hirschův index (Vesmír 85, 555, 2006/9) jeho prací je 33. Je členem Učené společnosti ČR a The Physiological Society (Londýn a Cambridge). Na Přírodovědecké fakultě UK v Praze a na Lékařské univerzitě v Kazani přednáší fyziologii živočichů a člověka. V roce 2011 získal čestnou oborovou medaili J. E. Purkyně a na návrh předsedy AV ČR medaili Josefa Hlávky.
Vyskočil František

Doporučujeme

Přemýšlej, než začneš kreslit

Přemýšlej, než začneš kreslit

Ondřej Vrtiška  |  4. 12. 2017
Nástup počítačů, geografických informačních systémů a velkých dat proměnil tvorbu map k nepoznání. Přesto stále platí, že bez znalosti základů...
Tajemná „Boží země“ Punt

Tajemná „Boží země“ Punt uzamčeno

Břetislav Vachala  |  4. 12. 2017
Mnoho vzácného zboží starověkého Egypta pocházelo z tajemného Puntu, kam Egypťané pořádali časté obchodní výpravy. Odkud jejich expedice...
Hmyz jako dokonalý létací stroj

Hmyz jako dokonalý létací stroj

Rudolf Dvořák  |  4. 12. 2017
Hmyz patří k nejdokonalejším a nejstarším letcům naší planety. Jeho letové schopnosti se vyvíjely přes 300 milionů let a předčí dovednosti všech...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné