Nepolapitelné chloridové kanály dopadeny

Kdybychom se zeptali náhodných chodců, co je to membránový iontový kanál, oslovený si vybaví třebas filtr na tvrdou vodu v kuchyni nebo tlakovou pumpičku, kterou používají na záchranném člunu k filtrování mořské vody dnešní trosečníci. Někdo si možná vzpomeneme na svého známého se špatnými ledvinami, který chodí na dialýzu krve. Zoologicky vzdělaní pak uvedou různou jedovatou žoužel jako hady, pavouky (černou vdovu),¹⁾ štíry, mořské ježíky, čtyřzubce (fugu)²⁾ či mlže homolice,³⁾ kteří zůstávají naživu díky tomu, že u svých obětí blokují membránové iontové kanály pro ionty sodné, draselné a vápenaté. Nebo má oslovený v rodině dokonce nemocného s cystickou fibrózou (viz Vesmír 75, 365, 1996/7) a ví, že tato obtížně zvládnutelná nemoc trápí nezanedbatelné procento obyvatel, kterým chybí v epitelech kanály pro další ionty, tentokrát chloridové. To vede k vysychání sliznic, protože u zdravých osob se spolu s chloridy do dýchacích cest a jiných tělesných kanálků přenáší voda a správně je zvlhčuje. Podobným syndromem, především úporným kašlem a sexuální i jinou „kanálkovou“ dysfunkcí, na sebe mohou upozornit i úporní kuřáci (viz Vesmír 85, 263, 2006/5).

Chloridové kanály řízené vápníkem

A právě na chloridové kanály jako by se v přírodě trochu zapomnělo, nemáme žádný pěkný, pro ně specifický toxin, který by je blokoval nebo je označil pro izolaci a chemickou analýzu. Snad z nouze by připadala v úvahu skupina chemikálií z rodiny stilbenů, ale ty jsou dost málo specifické. Přitom bychom nějakou metodu pro studium chloridových kanálků potřebovali, protože se podílejí na mnoha základních fyziologických procesech, jako je klidový membránový potenciál buněk. Také chloridové ionty tečou na povel gama-aminomáselné kyseliny do neuronů na tlumivých synapsích (což můžeme dále zesílit anxiolytikem diazepamem, a tím můžeme potlačit úzkost).

Kdysi jsme jako jedni z prvních registrovali chloridový kanál z neuroblastomových buněk metodou terčíkového zámku. Od té doby se rodina chloridových kanálů utěšeně rozrostla. Zvláštní pozornost si vydobyl jeden typ, který se snáze otevírá při zvýšení volného (ionizovaného) vápníku uvnitř buněk. Je fyziologicky velmi významný. Tyto vápníkem řízené chloridové kanály⁴⁾ podmiňují například dobrou sekreci chloridů a vody ve výstelkových epitelech, účastní se činnosti hladkých svalů, smyslových orgánů, elektrických reakcí řas a jiných rostlin. Bez tohoto typu chloridových kanálů bychom vůbec nevznikli, otevírají se totiž pro chloridy v okamžiku úspěšného vniknutí první spermie do vajíčka. Záporné chloridy uvnitř vajíčka zvyšují membránový potenciál a ten se stane nepřekonatelnou překážkou, která zabrání průniku dalších desítek či stovek spermií, čímž zamezí poškození vaječné buňky.

Onemocnění a poruchy kanálů

Tato nepřekonatelná překážka je ale také příčinou hned několika „kanálopatií“ (channelopathies). Patří k nim již zmíněná cystická fibróza, některá kostní onemocnění nebo vrozená oční choroba Bestova vitelliformní makulární dystrofie, která je charakteristická poruchou bílkoviny bestrofinu. To už víme, ale zbývá mnoho otázek. Je tento vápníkem aktivovaný typ chloridového kanálu něčím novým, nebo je to jeden z řady těch, které již byly popsány na jiných epitelových buňkách? Nízký vápník ho aktivuje, vysoký je bez účinku. Proč? Co se děje s jeho vápníkovým senzorem, která část molekuly bestrofinu je při této poruše sítnice oka pozměněná?

Protože různé chloridové kanály jsou prakticky všude, není problém změřit mikroelektrodami jejich elektrické charakteristiky pro určitou buňku. Takovým „otiskem prstu“ iontového kanálu (viz obr.) je vodivost nebo aniontová selektivita, citlivost na vápník a na membránové napětí. Neobyčejně obtížné je ale z nějakého buněčného zdroje získat ten protein dostatečně čistý, aby se dal použít pro studium jeho primární, sekundární, terciární i kvartérní struktury (krystalograficky), pro určení funkčně významných úseků podjednotek kanálu, jejich kritických oblastí a vazebných míst či řady jiných molekulárních vlastností, jež podmiňují správnou, nebo naopak porušenou funkci chloridového kanálu řízeného vápníkem.

Kdo tady dává povely?

V mnoha případech můžeme pro získání mikrogramových či vyšších množství určité bílkoviny použít expresní klonování. Do vhodných buněk – často se používají oocyty africké laboratorní žáby drápatky⁵⁾ – injikujeme mikropipetou informační nukleovou kyselinu: mediátorovou RNA. Ta může zpočátku nést povely pro řadu bílkovin, mezi nimi i pro hledaný iontový kanál. Jestli se vytvořil a (spolu s desítkami dalších proteinů) zabudoval do membrány,⁶⁾ to zjistíme za pár dní buď v elektrofyziologickém pokusu mikroelektrodou, která odhalí jeho „otisk prstu“,⁷⁾ nebo fluorescenční barvičkou. Pak se mediátorová RNA okrajuje a zkracuje, až nakonec zůstane pro expresi sotva pár desítek či stovek nukleotidů, kódujících jen ten jeden kanál.⁸⁾ Zjistí se v mRNA pořadí nukleotidů, a z něho se určí primární pořadí aminokyselin v kanálové podjednotce. Srovnáním zjištěné primární struktury se známými proteiny pak uvažujeme o sekundární struktuře,⁹⁾ terciární struktuře¹⁰⁾ i struktuře kvartérní. Co je důležité, odhadnou se také ty úseky podjednotek, které procházejí membránou, a ty oblasti, které vytvářejí vlastní iontový kanál nebo nesou regulační místa,¹¹⁾ popřípadě oblasti, jež mohou obsadit různé drogy a toxiny. Odhad se pak potvrzuje, nebo naopak vyvrací cílenými mutacemi, kdy v podezřelém řetězci proteinu nahrazujeme aminokyseliny jednoho typu za jiné.¹²⁾ Příslušný gen je možné pomnožit (například pomocí PCR) a v nějaké vhodné populaci buněk, jako jsou bakterie, kvasinky, epitelové buňky aj., namnožit takové množství proteinu, že ho lze krystalizovat a difrakcí rentgenových paprsků určit, jak asi náš nový krasavec vypadá v trojrozměrném, počítačově vybarveném zobrazení.

Co zjistili manželé Janovi

Vraťme se ale k chloridovým kanálům. Manželé Lilly a Yuh Nung Janovi z Lékařského ústavu Howarda Hughese v San Francisku, kteří se zabývají výzkumem draslíkových a chemicky řízených kanálů,¹³⁾ zjistili, že pro expresní klonování chloridových kanálů řízených vápníkem se ona jinak užitečná vajíčka žáby drápatky vůbec nehodí, protože už mají v membráně své vlastní chloridové kanálky, bránící zřejmě oplodnění mnoha spermiemi. Injikování mediátorové RNA, která je podezřelá z toho, že nese gen a povel pro expresi chloridových kanálů řízených vápníkem, by proto asi nejspíš nepřineslo nic nového. Manželé Janovi si ale v literatuře všimli jedné zajímavosti. Polyspermie byla popsána jako docela běžný jev u některých mloků. To by mohlo znamenat, že v mločích vajíčkách možná nejsou ty ochranné chloridové kanály, které by se otevíraly po vstupu první spermie a vedly k uvolnění vápníku z nitrobuněčných zásob. Proč tedy nevyužít pro klonování Ca⁺² nějakého mloka? Naštěstí se laboratorně chová a používá axolotl mexický.¹⁴⁾ To je ten slavný mlok, kterého už ve dvacátých letech minulého století studoval český profesor Vilém Laufberger. Zjistil tehdy, že když ho krmí štítnou žlázou obsahující tyroxin, může se z larválního stadia, v němž mlok běžně žije a rozmnožuje se,¹⁵⁾ změnit v dospělce. A tak si manželé Janovi opatřili axolotly, podáním hormonu je přinutili snést nezralá vajíčka, a pak začali studovat jejich kanálovou výbavu. A ejhle, oocyty sice měly protonové kanály (také nutné pro oplodnění), ale žádné kanály chloridové! Když do nich injikovali komplexní mediátorovou RNA z drápatky, objevily se v nich ohromné nanoampérové proudy Cl^– záhy poté, co v mločích vajíčkách povzbudili uvolnění Ca²⁺ z nitrobuněčných zásob.¹⁶⁾ Po náležitém „ořezání“ mRNA našli klon, který také produkoval chloridové proudy v přítomnosti vápníku. Zjistili, že takto získaná mRNA je šifrou proteinu o 979 aminokyselinách s předpokládanou molekulovou hmotností 113 kDa. Hledání v již existujících databázích ukázalo, že jde o drápatkový ekvivalent (ortholog¹⁷⁾) lidské a myší bílkoviny TMEM16A, člena rodiny M16 chloridových kanálů otvíraných elektrickým napětím a vápníkem. Mají 6 až 8 transmembránových segmentů a vyskytují se napříč celou říší eukaryot – od nálevníků a kvasinek až po člověka. Sekvence genu byla ihned umístěna do databáze GenBank s přístupovým číslem EU367938.¹⁸⁾

Odchycený gen znamená příležitost

S tímto genem v ruce mají teď vědci příležitost připravit potřebná množství přesně definovaných chloridových kanálů a testovat na nich nové léky proti řadě chorob ovlivněných nebo způsobených poškozenými chloridovými kanály. Jde nejen o zmíněnou cystickou fibrózu, ale také o astma, chronickou bronchitidu, vysoký krevní tlak, a možná dokonce i o některé agresivní druhy rakoviny s dosud špatnou prognózou léčení.

Tento případ mločích vajíček a chloridového kanálu je pěknou ukázkou vtipného uplatnění Kroghova principu na buněčné a molekulární úrovni. Dánský fyziolog cévních kapilár a nobelista August Krogh v dvacátých letech totiž vytyčil zásadu, že je třeba hledat pro každý problém ten nejvhodnější experimentální objekt. Manželé Janovi a jejich studenti tento objekt – mločí vajíčka – s úspěchem nalezli.

Tento výzkum byl podpořen granty IAA500110905 a AV0Z 0110509