Kterak kluk z Třince pomohl biotechnologické revoluci

O CRISPR/Cas píšeme ve Vesmíru čím dál častěji. Systém sestávající z enzymu štěpícího DNA a z molekul RNA, které ho navádějí k cíli, přirozeně využívají bakterie a archea v ochraně proti virům. Skutečnou slávu však zažívá až jeho lidmi upravená verze – mocný nástroj pro cílenou editaci genomu. Je to objev nobelovských parametrů (aktualizace 7. 10. 2020: dnes už doslova). V souvislosti s ním se proslavili především vedoucí příslušných výzkumných týmů: Jennifer Doudnaová, Emmanuelle Charpentierová, Feng Zhang a Virginijus Šikšnys. Ale významnou roli v tomto příběhu hraje i český rodák Martin Jínek, mimo jiné první autor jednoho z klíčových článků v Science.

Do Berkeley k Jennifer Doudnaové jste z Heidelbergu přišel už s tím, že se budete věnovat CRISPR, nebo jste se k němu dostal až v Kalifornii? — Až tam. Do skupiny jsem jako postdok nastoupil v lednu 2007. Dělal jsem hlavně na projektech, které se týkaly regulace genové exprese v eukaryotních buňkách pomocí miRNA a mechanismům s tím souvisejícím. V té době už vycházely první články popisující CRISPR jako součást imunitního systému prokaryotních buněk. Do laboratoře k Jennifer přišel jako postdok Blake Wiedenheft (dnes má laboratoř v Montaně), který se tomu chtěl věnovat. To on do Berkeley CRISPR přinesl. Ale byl původním zaměřením mikrobiolog. Neuměl dělat strukturní biologii a potřeboval, aby mu někdo pomohl se strukturami proteinů, které v systému CRISPR fungují. Tak začal spolupracovat se mnou.

Čímž se vám otevřelo nové, a jak se brzy ukázalo, mimořádně zajímavé téma. — Ano, ke CRISPR jsem se dostal přes struktury některých souvisejících proteinů. Nejprve jsem s Blakem dělal na proteinu Cas1, rozluštili jsme jeho trojrozměrnou strukturu. První roky jsem jako strukturní biolog víceméně pomáhal lidem, kteří se tomu věnovali na sto procent, a sám jsem zároveň pracoval na svých projektech.

A jak se stalo, že se CRISPR stal vaším hlavním tématem? — Postupně jsem dokončil projekty, které jsem v Berkeley jako postdok začal, a koncem roku 2010 jsem se rozhlížel, co dalšího bych mohl dělat. Chtěl jsem se hlásit do výběrových řízení na pozice vedoucího skupiny, ale věděl jsem, že to bude ještě nějakou dobu trvat. Bylo zřejmé, že v laboratoři u Jennifer budu moci ještě tak rok nebo dva zůstat. A sešlo se to tak, že v té době vyšel týmu Emmanuelle Charpentierové v Nature první článek o tracrRNA,¹⁾ na jehož základě se rozjela spolupráce s laboratoří Jennifer Doudnaové. A já jsem chtěl být tím člověkem, který by na straně Berkeley v rámci této spolupráce dělal experimenty. Byl jsem zkrátka ve správný čas na správném místě.

Co vás na CRISPR tak přitahovalo? Tušil jste od začátku, jak důležitý biotechnologický nástroj se vám rodí pod rukama? — Vždy mne fascinovala RNA a její role při regulaci nejrůznějších buněčných mechanismů – genové exprese, obrany před viry a podobně. No a čím déle jsme pracovali na systému CRISPR, tím bylo jasnější, že to je mechanismus, který využívá naváděcí RNA, takže tam jsou paralely k RNA interferenci a podobným mechanismům. Ale enzymy důležité pro CRISPR nemají žádnou spojitost s komponenty RNA interference. Je to mechanismus využívající naváděcí RNA, cílem však tentokrát není jiná molekula RNA, ale dvoušroubovice DNA. Koncepčně to je velice podobné, ale mechanismus v mnohém odlišný. Takže se otevírala spousta otázek, jimž bylo lákavé přijít na kloub. To byla moje hlavní motivace.

Jak probíhal výzkum, který v roce 2012 vyústil v článek v Science, jehož jste prvním autorem?²⁾ — Nejprve jsme museli enzym Cas9 rekombinantně exprimovat v bakteriích, izolovat ho, připravit ho v aktivním stavu. Potom jsme začali zkoušet, co všechno umí. Měli jsme hypotézu, že to je endonukleáza pro štěpení DNA, která však není na cílové místo naváděna pomocnými proteiny, ale specifickou sekvencí RNA. Takže následovala řada biochemických experimentů, díky nimž jsme tuto aktivitu charakterizovali. Většina z toho byla taková biochemie staré školy – vše se dělalo elektroforézou a pomocí radioizotopového značkování.

A hypotéza se potvrdila… — Ano, první experimenty naznačily, že Cas9 je opravdu endonukleáza, která stříhá DNA v místě určeném sekvencí naváděcí molekuly RNA. To byl naprosto bezprecedentní mechanismus, nikdo předtím nic podobného nikde v přírodě nepozoroval. Věděli jsme, že jsme na stopě něčeho velkého.

Prof. Martin Jínek (*1979) Pochází z Třince, kde studoval gymnázium, ale už v sedmnácti letech odešel na The Oratory School v anglickém Readingu. Z ní pokračoval studiem biologie a chemie na Trinity College v Cambridge (1998–2002), doktorské studium absolvoval v Evropské laboratoři molekulární biologie (EMBL) v Heidelbergu (2006). V letech 2007 až 2012 působil jako postdok ve skupině Jennifer Doudnaové na Kalifornské univerzitě v Berkeley, od roku 2013 působí na Curyšské univerzitě, kde má vlastní skupinu. Zabývá se interakcemi mezi RNA a proteiny, rolí RNA v regulaci buněčné exprese a výzkumem systému CRISPR/Cas jako nástroje pro editaci genomu. Pracuje metodami biochemie, molekulární biologie a strukturní biologie. Má na kontě řadu publikací v nejvyhlášenějších vědeckých časopisech, mnohdy jako první nebo korespondenční autor – kromě v rozhovoru probíraného článku v Science (2012) i další v Science (2010, 2014, 2015), Nature (2× 2009, 2× 2014, 2017), PNAS (2017)… – seznam by byl dlouhý. V roce 2013 získal startovací ERC grant (projekt ANTIVIRNA), v roce 2018 navázal grantem konsolidačním (projekt CRISPR2.0). Za svou práci obdržel řadu ocenění, například v roce 2014 John Kendrew Award od EMBL, o rok později švýcarskou Friedrich Miescher Prize nebo Vallee Young Investigator Award, mezinárodní cenu pro mladé vědce, kteří dosáhli mimořádných úspěchů v biomedicíně. Je také mezinárodním stipendistou americké nadace Howard Hughes Medical Institute, jedné z nejprestižnějších filantropických organizací podporujících biomedicínské vědy.Snímek Universität Zürich

Začali jste přemýšlet, jak by se systém CRISPR/Cas dal zkrotit a využít k cíleným zásahům do DNA? — V té době začínala editace genomů nabírat na obrátkách. Po nukleázách využívajících zinkové prsty přišly v letech 2010–2011 TALEN nukleázy.³⁾ Jednodušší, modulárnější, dalo se s nimi lépe pracovat, takže se rychle rozšířily jako experimentální nástroj. A my jsme měli v ruce programovatelnou nukleázu, která by potenciálně šla využít podobně a ještě snadněji. Dalším logickým krokem proto bylo prokázat, že je to opravdu univerzálně programovatelný systém, který by mohl sloužit jako základ nové technologie pro editování genů a genomů.

Jak jste postupovali? — Experimenty směřovaly k tomu, jak systém zjednodušit, aby nebyl závislý na některých z mechanismů využívaných prokaryotními buňkami k přesnému zpracování naváděcí RNA. Součástí přirozené struktury jsou dvě molekuly RNA – crRNA a tracrRNA. Nás napadlo tyto molekuly spojit. Vzali jsme crRNA, která má naváděcí funkci, a její 3' konec jsme přes krátkou spojovací sekvenci navázali na 5' konec tracrRNA, která má koaktivační funkci. Systém se zjednodušil na komplex jednoho proteinu s nukleázovou aktivitou a jedné molekuly RNA.⁴⁾ Tento experiment nám dal víru v to, že CRISPR/Cas bude fungovat jako editační nástroj. Tím ten článek v Science končil.

Zbývalo upravit systém tak, aby fungoval i u eukaryot (včetně člověka). Co k tomu bylo potřeba dořešit? — Odstartovala soutěž o to, komu se podaří tento další krok učinit. V roce 2013 vyšla první série článků. Publikovaly je týmy z MIT a Harvardu,⁵⁾ my⁶⁾ a další tři skupiny – všichni jsme nezávisle na sobě přišli s víceméně stejným řešením. Bylo potřeba několik věcí. K proteinu Cas9 se musí přidat krátká sekvence, která funguje jako lokalizační signál pro buněčné jádro, do kterého se protein musí dostat. Prokaryotní buňky jádro nemají, takže nic takového Cas9 přirozeně nepotřeboval. Dále bylo třeba navrhnout způsob, jak tu RNA v buňkách exprimovat. To se vyřešilo metodami, které se už tou dobou používaly třeba pro genovou represi pomocí RNA interference.

Snímek z roku 2010, kdy Martin Jínek působil jako postdok na Kalifornské univerzitě v Berkeley. Zleva Martin Jínek, Rachel Haurwitzová, Blake Wiedenheft (který téma CRIS PR do Berkeley přinesl), Kaihong Zhouová a vedoucí skupiny Jennifer Doudnaová.Snímek © 2010 The Regents of the University of California, the Lawrence Berkeley National Laboratory

Jak se vlastně nukleáza s naváděcí RNA do cílové buňky dostane? — Postupů je víc, protože každý organismus a každá tkáň v rámci organismu má svá specifika. Jednou z možností je vpravit do buňky DNA kódující jak protein, tak naváděcí RNA. Třeba pomocí lipozomálních váčků, které splynou s buněčnou membránou. Nebo elektroporací: buňky vložíte do kyvety s elektrodami, do média přidáte protein nebo kódující DNA, elektrickým výbojem dočasně narušíte strukturu membrány a vaše „zásilka“ pronikne do buňky. Pro dopravu DNA se používají i na virech založené vektory. A jsou-li buňky dostatečně velké, třeba vajíčka, můžete do nich vložit vše potřebné mechanicky – vpichem mikrokapiláry. Pořád se pracuje na dalších metodách umožňujících například vyšší specificitu, přenos jen do určitých buněk…

O možnostech, které CRISPR/Cas přináší, se v poslední době píše hodně, většinou se však pomíjejí mechanismy, jimiž k editaci dochází. Můžete je alespoň zjednodušeně popsat? — V základní podobě tento systém slouží k deaktivaci vybraného genu. Máte programovatelnou nukleázu, která ve vámi zvoleném místě rozstřihne DNA. S dvouřetězcovými zlomy se buňky potýkají neustále, dochází k nim působením UV záření, kosmického záření a dalších faktorů v životním prostředí. Takže prokaryotní i eukaryotní organismy mají poměrně sofistikované mechanismy pro opravu poškozené DNA. Pokud vám jde o vyřazení genu z provozu, stačí tedy DNA rozstřihnout, a tím se nastartují přirozené opravené procesy. Uplatní se takzvané „nehomologní spojení konců“ (NHEJ), které řetězce „slepí“, ale ne úplně přesně. Je to hrubá oprava, při které se často nějaký nukleotid přidá, nebo naopak vypadne. Takto mutovaný gen pak ztratí svou funkci.

A co když nám nejde o deaktivaci genu, ale o jeho cílenou úpravu? — Pokud potřebujete být přesní, chcete třeba opravit mutaci způsobující nějakou dědičnou chorobu, můžete využít jiného opravného mechanismu – homologní rekombinace. Endonukleáza DNA opět v cílovém místě přeruší, ale zároveň musíte do buňky vpravit předlohu, podle které se takto vyvolané poškození opraví. U bodových mutací k tomu stačí krátký jednovláknový oligonukleotid s upravenou sekvencí. Na obou koncích je homologní k tomu úseku, v němž jste DNA přerušili, a uprostřed má požadovanou změnu. Oligonukleotid se dočasně spáruje s nastřiženou DNA, kterou DNA polymeráza podle tohoto vzoru opraví.

V jedné vaší přednášce ale mluvíte i o tom, že bodové mutace lze dělat bez nutnosti dvouřetězcového zlomu DNA. — Způsobem, který jsem právě popsal, se to dělá nejčastěji, ale skutečně existují i novější postupy využívající takzvané editory bází. Ty byly vyvinuty v posledních třech letech. Využívají upravený Cas9, který ztratil schopnost rozstřihnout DNA, protože má nukleázová aktivní místa mutovaná. Z nukleázy se stal protein naváděný RNA, který se umí navázat na DNA v přesně definovaném místě, ale nepoškodí ji. A takový protein můžete pomocí různých metod sfúzovat s jinými proteiny, které mohou vykonat nějakou další práci. V případě editorů bází to jsou deaminázy, které deaminují cytidin (C) na uridin (U) nebo adenosin (A) na inosin (I). Když se potom buňka replikuje, I se překopíruje jako G a U jako T.

To už je opravdu hodně sofistikované hraní s molekulární stavebnicí. Když jste mluvil o knokautování genů pomocí mechanismu NHEJ, říkal jste, že se využívá jeho chybovost. Ale přece jen bych očekával, že se buňka snaží dělat chyb co nejméně. Nesnižuje to efektivitu podobných zásahů? — To není větší problém, ten mechanismus opravdu není moc přesný. Spíše je těžké dosáhnout dostatečné přesnosti, když ji potřebujeme. Protože homologní rekombinaci buňky používají, jen když se aktivně dělí. Po většinu buněčného cyklu je tento mechanismus neaktivní. Pořád se vyvíjejí nové postupy ve snaze dosáhnout toho, aby oprava pomocí homologní rekombinace byla jednodušší a účinnější, aby ji šlo efektivně využít i v buňkách, které se nedělí.

Jak velký problém dnes představuje omezená citlivost CRISPR/Cas, kvůli které může zasáhnout i ta místa DNA, v nichž to není žádoucí? — Samozřejmě to jistý problém je. Obzvláště u terapeutických aplikací to bude nutné pečlivě sledovat a mít metody pro detekování možných necílových aktivit. Také bude třeba dále pracovat na úpravě příslušných proteinů a RNA, aby měly vyšší specificitu. CRISPR do určité míry toleruje nepřesné párování mezi RNA a DNA. Pokud se nějaká sekvence liší od té cílové třeba dvěma nebo třemi bázemi, systém to ještě dost možná bude tolerovat. Záleží na tom, jaké přesně ty rozdíly jsou, v jaké pozici v rámci cílového místa a podobně. Ono se není co divit, CRISPR jistou toleranci pro svou biologickou funkci potřebuje. Nesmíte zapomínat, že jeho prvotní funkcí je obrana proti virům. A viry dokážou rychle mutovat a příliš citlivému nástroji by se mutací v cílovém místě snadno vyhnuly. Některé postupy už byly publikovány. Existují nové, vysoce citlivé varianty Cas9 a Cas12, stejně jako modifikované naváděcí RNA. Takže komplikace to je, ale řešitelná.

Čím se vaše skupina na Curyšské univerzitě zabývá nyní? — Co se týče CRISPR/Cas, pořád ještě studujeme molekulární mechanismy těch nukleáz. Pomocí strukturní biologie se snažíme zjistit, jak fungují. Jak se vážou na DNA, jakým způsobem ji stříhají, jak se jejich aktivity v buňce koordinují a regulují. Doufáme, že poznatky, které náš výzkum přinese, budou využitelné pro další vývoj nástrojů pro editaci genomu, aby byly přesnější, aktivnější a měly větší aplikační potenciál.

Nejznámější z nukleáz spřažených s CRISPR je Cas9, vy ale studujete i další. — Pracujeme nejvíc na třech – Cas9, Cas12 a Cas10. Na některých nás zajímají spíše základní biologické otázky, zabýváme se jejich prvotní funkcí v obraně proti virům. U jiných, především Cas9 a Cas12, sledujeme i jejich možné uplatnění v aplikacích. Ale pořád je to primárně základní výzkum. K němu jsem měl vždy nejblíž. Nechci se posouvat do role čistého developera technologií. Těší mne, když se k aplikacím můžeme dostat, třeba spoluprácí s jinými skupinami, ale také mi úplně stačí, když někdo využije námi popsané struktury a mechanismy, naše biochemická a biofyzikální data k vývoji něčeho užitečného. Ale moje hlavní motivace to není.

V Kalifornii jste nicméně s kolegy z univerzity spoluzaložil firmu Caribou Biosciences, jejímž cílem je komerční využití CRISPR/Cas. A stále v ní působíte. — To je další aktivita, která mne zaměstnává a nutí mne k jinému způsobu myšlení. Z vědeckého hlediska se tam řeší trochu jiné problémy směřující více do praxe, včetně genové terapie. Jsem tam spolu s Jennifer Doudnaovou členem vědecké rady, takže pomáhám konzultacemi, ale tu firmu neřídím. Nejsem manažer, nemám zkušenosti z farmaceutického průmyslu. Na to tam jsou profesionálové.

Jak se vyvíjí situace kolem patentů na využití CRISPR/Cas? Přiznám se, že se v tom poněkud ztrácím. — Situace je komplikovaná, protože jak MIT, tak Berkeley mají několik přiznaných patentů. Formálně se nevylučují, ale pro některé aplikace si nevystačíte s patenty jen jedné strany. Oprávněnost některých patentů je neustále předmětem sporu. Původní patenty byly podány ještě za starého patentovacího systému, kterému se říká „first to invent“.⁷⁾ To znamená, že nerozhoduje, kdo první patent podal, ale zjišťuje se, kdo příslušnou věc první vymyslel nebo vynalezl. Jde se při tom do velkých detailů. Zkoumá se, kdy měl kdo v laboratorním deníku jaká data, kdy provedl jaké experimenty a jestli ty experimenty opravdu dokazují, že nějaká novinka funguje. Takže patentový úřad průběžně vyhodnocuje, zda patenty různých stran nejsou ve vzájemném konfliktu – a pokud jsou, komu náleží priorita.

Myslíte, že to spěje k nějaké dohodě mezi Kalifornskou univerzitou a MIT? — To si netroufám odhadnout. Jsem sice vedený jako jeden ze spoluvynálezců na patentech Berkeley, ale protože tam už nepracuji, mám omezený přístup k informacím.

Kromě CRISPR/Cas se v Curychu věnujete i jiným tématům? — Ano, pocházím z oboru strukturní biologie RNA a proteinů, takže moje skupina zčásti pracuje na různých enzymech, které se podílejí na úpravách RNA řídících expresi genů v eukaryotních buňkách. Věnujeme se třeba polyadenylaci mRNA, tedy otázce, jakým způsobem eukaryotické mRNA získávají polyA-ocas na svém 3' konci. Polyadenylace mRNA stabilizuje, usnadňuje její transport z jádra do cytoplazmy a je potřebná pro její translaci.

Na rutinní nasazení CRISPR/Cas v humánní medicíně si ještě počkáme, ale jak daleko je komerční využití v zemědělství? — Na trhu zatím nic není, ale objevují se první náznaky. Jedna americká firma pomocí CRISPR vyvinula žampiony s knokautovaným genem, který v nemodifikovaných houbách po rozkrojení houby způsobuje její hnědnutí, což omezuje dobu, po kterou ji můžete mít na pultech.⁸⁾ Americké ministerstvo zemědělství prohlásilo, že tyto žampiony nepovažuje za GMO, takže se jich netýkají příslušné regulace. Nyní čekají na standardní schválení FDA a budou moci na trh. Protože to byl opravdu jen knokaut genu, nelze ani prokázat, že to bylo uděláno pomocí CRISPR/Cas. Stejného výsledku lze docílit náhodnou mutagenezí.

Evropská unie se ale k regulaci plodin připravených pomocí CRISPR/Cas staví jinak. — Ano, Evropský soudní dvůr loni vydal rozhodnutí, podle kterého jsou takové plodiny považovány za GMO.⁹⁾ Ale pokud bude CRISPR/Cas použit pro knokauty genů, nikoli pro vložení nějaké exogenní DNA, nelze rozlišit, zda výsledku bylo dosaženo pomocí CRISPR, nebo indukovanou mutagenezí, na kterou se regulace nevztahuje. V tom rozhodnutí je mezera, regulační orgány budou mít problém to kontrolovat.

Loni jste na jedné přednášce říkal, že použití CRISPR/Cas u lidí předtím, než konkrétní metoda projde klinickými zkouškami, které ověří její bezpečnost, nepovažujete za velký problém, protože vnitřní regulace vědecké komunity je velmi silná a něco takového nikdo riskovat nebude. Koncem roku však čínský vědec Che Ťien-kchuej oznámil eticky velmi problematické narození dvojčat s editovaným genomem.¹⁰⁾ Byl Ťien-kchuej předtím v CRISPR komunitě známý? — Nebyl, vynořil se zčistajasna. Byl na periferii dění, pracoval na nějakých sekvenačních projektech jako postdok v Americe, pak se vrátil do Číny a začal to dělat na vlastní pěst ve spolupráci s jednou reprodukční klinikou.

Považujete to za výjimečnou událost, nebo bude podobných případů přibývat – i s ohledem na velkou konkurenci a tlak na výsledky mezi čínskými vědci? — Myslím, že to posloužilo jako dobrý odstrašující příklad. Reakce na tento počin byla silně negativní, i přímo v Číně. Zavládlo rozhořčení a znepokojení, že někdo takto poškodil obraz čínské vědy. Předpokládám, že se do toho hned tak někdo další v Číně nepustí.

Takže si i po této zkušenosti stojíte za tím, že ochranné mechanismy fungují a tohle byla výjimka potvrzující pravidlo? — V zásadě ano. I když další kapitolou by mohl být ruský vědec Denis Rebrikov, který tvrdí, že chce zkusit něco podobného. Dost dobře nechápu, proč to ti lidé dělají. Jestli je to snaha se zviditelnit, užít si svých patnáct minut slávy i za cenu problémů, které jim můžou dost razantně ukončit kariéru…

Co když se to někde rozjede se státní podporou? Vzpomeňme na státem podporovaný doping v bývalém východním Německu… — V nějakém opravdu autoritářském režimu by k tomu asi dojít mohlo, ale na druhou stranu – takové použití CRISPR/Cas vyžaduje umělé oplodnění. Aby se něco takového rozšířilo, muselo by to být opravdu řízeno na státní úrovni, s masivními investicemi a zásahy do základních lidských práv. A dost dobře si nedokážu představit, že by lidé, byť v autoritářské společnosti, tak razantní zásah do své reprodukční svobody byli ochotni přijmout.

Setkali jsme se v Praze, kde jste se na pozvání Ústavu organické chemie a biochemie AV ČR zúčastnil konference EMBO Young Scientists Forum. Jak často do Česka jezdíte? — Tak dvakrát, třikrát do roka. Odešel jsem v sedmnácti, mimo české prostředí jsem už strávil více než polovinu života.

Uvažujete o tom, že byste se sem vrátil na stálo? — Úplně vyloučit to nemůžu, ale momentálně tímto směrem nepřemýšlím. Moje partnerka je Němka, stěhování do České republiky jsme zvažovali v době, kdy jsem se rozhodoval, na jaké místo se po postdoku hlásit, ale rozhodli jsme se jinak a od té doby to nikdy nebylo aktuální.