Serendipity aneb Lekce z dějin antabusu

Měl jsem čerstvě po ukončení doktorátu z anorganické chemie, během kterého jsem se věnoval syntéze komplexů niklu s dithiokarbamátovými ligandy a jejich fyzikálně-chemickému studiu. Napadlo mne, když jsem četl desítky článků o biologické aktivitě disulfiramu a dithiokarbamátů (a napsal jsem o tom poměrně rozsáhlý článek do Current Pharmaceutical Design), že pokud je protinádorová aktivita disulfiramu potencována přítomnosti měďnatých iontů, musí být aktivní látkou CuEt. Syntetizoval jsem si tehdy tři komplexy diethyldithiokarbamátu s niklem, mědí a zinkem a označil jsem je NiEt, CuEt a ZnEt. A toto označení se v případě CuEt za deset let mělo dostat až do Nature. V prvních experimentech s těmito látkami jsem ukázal, že CuEt a ZnEt – na rozdíl od NiEt – velmi efektivně zabíjejí nádorové buňky.

Hlavní literatura, o kterou jsem se opíral, byl článek z Cancer Research z roku 2006, který publikovala skupina prof. Q. P. Doua z Karmanos Cancer Institute v Detroitu. Oni tvrdili, že směs disulfiramu a mědi (měďnatých iontů) inhibuje purifikovaný 20S proteazom. Já jsem naopak ze své rešerše usoudil a publikoval (už zmíněný článek v Curr. Pharm. Des.), že CuEt a ZnEt neinhibují 20S proteazom, ale tzv. JAMM doménové proteiny. Co bylo naprosto jasné, je fakt, že jsem se při studiu těchto problémů musel stát expertem na tzv. ubikvitin-proteazomový systém v buňce, což je mašinérie zodpovědná za rozklad, např. nepotřebných, proteinů. Bylo to fascinující dobrodružství. Ten obor měl tehdy nesmírnou dynamiku od základních otázek molekulární biologie (Nobelova cena za chemii z roku 2004) po nové léčebné aplikace. První inhibitor proteazomu, bortezomib, k jehož objevení vedla také jen shoda náhod, byl v roce 2007 používaný v klinické léčbě mnohočetného myelomu a vydělával miliardy dolarů. Mými hrdiny se stali lidé jako A. Goldberg, T. Maniatis, A. Hershko, A. Ciechanover, C. M. Pickart, R. J. Deshaies, J. Adams, K. C. Anderson. Byl to můj soukromý svět a potřeboval jsem zpětnou vazbu.

Tu mi nejprve poskytli, když jsem našel odvahu a napsal jim e-mail, profesoři M. L. Schmitz a Y. Ben-Neriah. Moje myšlenky jim dávali smysl a dali mi svolení, zmínit jejich jména v poděkování ve svém článku v Curr. Pharm. Des. Pak jsem psal přímo Douovi do Detroitu, zda by nebyl ochotný testovat mé látky na 20S proteazomu. Opravdu ho to zajímalo a za měsíc, v červenci 2007, jsem měl výsledky: žádná z těch tří látek, ani CuEt, ani ZnEt, ani NiEt, neinhibuje purifikovaný 20S proteazom. A tady jsme se myšlenkově rozdělili: pro Doua stále platilo, že disulfiram s Cu²⁺ je inhibitorem 20S proteazomu, zatímco CuEt byla nějaká podivná „tvoje látka“, která s disulfiramem moc nesouvisí. Pikantní na tom byl fakt, že obrázek, který v jeho článku ukazuje, že směs disulfiramu s Cu²⁺ inhibuje 20S proteazom, demonstruje také, že to samé dokáže i samotný měďnatý iont. Pochopení triviálního faktu, že v reakční směsi zůstávají také reaktanty, se ukázalo jako nepřekročitelná mentální propast. Ba vůbec chemický pohled na směs disulfiramu s Cu²⁺ byl prakticky tabu. Směs disulfiramu s Cu²⁺ podle Doua a mnoha a mnoha jiných výzkumníků až dodnes nebyla a není ani Cu²⁺, ani CuEt, ani disulfiram, ale „disulfiram ve směsi s mědí“ (opravdu s „mědí“, ne s „měďnatými ionty“!).

Během roku 2007 jsme s Douem čekali na další výsledky. V červenci 2007 se mi totiž podařilo přesvědčit prof. R. J. Deshaiese z Caltechu v Pasadeně, aby testoval aktivitu mých látek proti JAMM doménovým proteinům. Jsou to proteiny, které mají klíčovou roli při činnosti ubikvitin-proteazomového systému, což Deshaiesův tým popsal ve dvou průkopnických článcích v Science v roce 2002. Vědecká úroveň Deshaiesovy skupiny byla nesrovnatelně vyšší než skupiny Douovy, jeho způsob myšlení dodnes považuji za vzor (a měl jsem to štěstí s ním později komunikovat i osobně), nicméně metody pro testování aktivity JAMM doménových proteinů bylo tehdy potřeba teprve zavést, nešlo o žádnou rutinu. Takže konečné výsledky – negativní – jsem dostal až v srpnu 2012.

Už v létě 2008 jsme se s Douem bez ohledu na Deshaiese rozhodli publikovat své výsledky, které jsem opředl složitou spekulací o možném chemismu interakce CuEt a ZnET s JAMM doménovými proteiny. Tento článek vyšel v Journal of Medicinal Chemistry.  Do spolupráce se během roku 2009 zapojil také prof. J. Bártek, který v té době zakládal v Olomouci svou laboratoř. Podrobně a často jsem se o svém výzkumu bavil s vedoucím jeho laboratoře, M. Mistríkem, který navrhoval nové možnosti, jak testovat mou hypotézu. Důležitou událostí těchto let, kdy se čekalo na Deshaeisovy výsledky, byl test disulfiramu na myších, které měly xenografty s lidskou rakovinou prsu. Kontaktoval jsem totiž někdy na jaře 2009 Ligu proti rakovině, zda by neměla prostředky na financování klinických studií antabusu u lidí s rakovinou. Doc. Z. Dienstbier mi tehdy nabídl peníze na testy na myších, které měly probíhat u doc. P. Poučkové na 1. LF v Praze. A to se skutečně podařilo. Výsledky byly nádherné: u myší, které dostávaly disulfiram v dávce odpovídající té, která je používaná u alkoholiků, se nádory zmenšily po 30 dnech o 60% a u myší, které dostávaly disulfiram a glukonát měďnatý, o 80%. Nikdo v té době – to byl už rok 2010 – žádné tak zásadní výsledky neměl. Publikována tato data byla však až v našem Nature, tedy nás mezitím v tomto jiní předběhli.

Zlom, jak už jsem zmínil, nastal v srpnu 2012, kdy Deshaiesův tým jasně prokázal, že CuEt není schopen inhibovat JAMM doménový protein, spojený s proteazomem, známý jako Rpn11. O ZnEt jsme postupně ztratili zájem proto, že z hlediska chemických afinit nemůže v těle, kde jsou přirozeně přítomné i měďnaté ionty, existovat. Měďnatý ion prostě ten zinečnatý vytěsní. O CuEt naopak bylo už v roce 1997 – ale bez jakékoli souvislosti s léčbou rakoviny – prokázáno, že existuje v mozku myší, kterým se podá ditiocarb (Suzuki et al. Biochimica et Biophysica Acta 1997). Zásadní roli v této kritické situaci a pak během celého výzkumu sehrál Zdeněk Škrott, student, kterému jsem dělal vedoucího bakalářské a pak i magisterské diplomové práce.

V létě 2012 během stáže (podrobnosti o financování našich stáží v USA jsem zveřejnil už ve svém článku v roce 2013: Vesmír 92, 43, 2013/1) u Doua v Detroitu Zdeněk potvrdil pozorování M. Mistríka, že CuEt v buňkách způsobuje akumulaci ubikvitinovaných proteinů. Pro mnohé výzkumníky tehdy i dnes jde o dostatečný důkaz inhibice proteazomu. Deshaies mi ovšem v červenci 2012 na Caltechu vysvětlil, že příčin tohoto jevu může být celá řada, např. nějaký typ buněčného stresu, tedy vliv CuEt na degradaci proteinů by byl jen nepřímý. Mezitím bylo naprosto jasné, že CuEt není schopen inhibovat purifikovaný 20S proteazom, ani 20S proteazom v buňkách. Na podzim 2012 jsem měl vážné obavy, že CuEt nemá žádný specifický cíl v buňce a všechno naše úsilí je a bude marné. Naději přinesl před Vánocemi toho roku Zdeňkův experiment, který ukazoval, že CuEt inhibuje degradaci IkappaB. Degradace IkappaB je asi historicky nejlépe popsaný děj, závislý na klasické degradaci proteinů: nejprve je ubikvitinován, pak se uvolní z proteinového komplexu a nakonec dojde k jeho rozkladu v proteazomu. Zdeňkova data byla přesvědčivým argumentem i pro Deshaiese, aby se CuEt vrátil do hry jako specifický inhibitor degradace proteinů. To pak Zdeněk potvrdil i během své stáže v Deshaisově laboratoři na Caltechu v létě 2013. Stále však zůstala otevřená otázka, co je vlastně jeho cílem v buňce.

Někdy v lednu 2013 Zdeněk prezentoval na semináři naší skupiny informace o proteinu, známém jako p97. Tato atpáza působí přesně mezi ubikvitinací a degradací, je zodpovědná za uvolňování ubikvitinovaných proteinů z větších komplexů, aby mohly být degradovány v proteazomu. Inhibice p97 způsobuje stejnou akumulaci ubikvitinovaných proteinů jako inhibice proteazomu. Bohužel, jak se později ukázalo – a to už Zdeněk pracoval jako doktorand pod vedením M. Mistríka – CuEt nedokázal inhibovat enzymatickou aktivitu p97, ale zároveň nedokázal bránit degradaci proteinu, který byl na p97 nezávislý. Klíčové bylo nečekané pozorování, že CuEt fixuje p97 na buněčných strukturách, kam přišla uvolňovat ubikvitinované proteiny. Po přistání na místo určení se z něho v buňkách, které v sobě měly CuEt, nedokázala normálně odlepit. Měli jsme štěstí, že o mechanismu působení p97 bylo již dosti známo, takže jsme hledali mezi proteiny, které byly součástí komplexu nutného ke správnému fungování p97. Díky obrovskému množství práce Zdeňka, M. Mistríka a jejich kolegů na Ústavu molekulární a translační medicíny a nesmírně cenným interpretacím experimentů ze strany J. Bártka se jako buněčný cíl CuEt vyloupl protein Npl4, o němž to nikdo vůbec nepředpokládal. CuEt způsobuje, a to i v tumorech u myší, fixaci Npl4, tím i fixaci p97 a inhibici degradace proteinů (těch závislých na p97, což je většina normálně degradovaných proteinů). Fixace p97 nikdy předtím nebyla pozorována a konečně se mi zdálo, že i Deshaies, jehož skupina se výzkumu p97 intenzivně věnovala, měl pocit, že jsme objevili něco zásadního.

Když si přečtete učebnice medicinální chemie, dozvíte se, že typickým cílem molekul, z nichž se mají stát efektivní léky, v buňce jsou enzymy, receptory a DNA (DNA kvůli cisplatině). Npl4 není ani jedno, jeho jediná „aktivita“ je vytvářet lešení pro správnou funkci p97. To byl podle mne důvod, proč se v případě CuEt nedařil tzv. rescue experiment. V případě enzymů by tento experiment měl být velmi hladký: buňka, která je vystavena působení inhibitoru enzymu, který by ji normálně zabil, je zachráněna umělým zvýšením produkce tohoto enzymu v ní. Enzym je jako továrna. Zničíte-li továrny v buňce, zachráníte ji vystavěním nových. Ale co když vaše molekula zastaví buněčné děje tím, že z běžného proteinu udělá lepidlo, které všechno zalepí? Zachráníte ji tím, že zvýšíte produkci tohoto proteinu? Není to tak jasné, jako když jde o enzymy. Z hlediska lékařského je to ovšem spíše výhoda, neboť čím obtížněji se zasažená buňka bude zachraňovat, tím obtížněji si vytvoří rezistenci na váš lék.

Velkým paradoxem ovšem bylo a je, jak je možné, že disulfiram nemá vážné vedlejší účinky jako klasická chemoterapie. Alkoholici ho berou po desítky let bez velkých problémů. Klíčem k odpovědi je nejspíše další převratné zjištění našeho článku. V roce 2014 Zdeněk se svými kolegy řešili úkol, jak měřit CuEt ve zvířatech a lidech. Ačkoli by se na první pohled mohlo zdát, že to je snadná práce ze základní analytické chemie, bylo to dramatické dobrodružství, trvající více než půl roku. A zjistilo se, že CuEt se u myší, které měly ve stravě disulfiram, a zejména u těch, které braly i glukonát měďnatý, hromadí v tumorech; stejně tak se zjistilo, že je přítomný, ale v malé koncentraci, v krvi alkoholiků, kteří berou antabus. Je tedy jasné, proč alkoholici nepociťují žádné toxické vlastnosti CuEt (a toxická látka to rozhodně je, 10 mg na kilogram zabije myš), neboť toxicita závisí na koncentraci. Jestliže je pravda, a to by se teprve muselo ukázat u pacientů s nádorovými onemocněními, že ve zdravých tkáních je při léčbě antabusem v kombinaci s nějakým potravním doplňkem, obsahujícím měďnaté ionty, CuEt prakticky nepřítomen, zatímco v nádoru je ve vysoké koncentraci, pak je jasné, proč by tito pacienti neměli mít vážné nežádoucí účinky, typické pro běžnou chemoterapii. Výzkum možností, jak dosáhnout hromadění protinádorových léků v nádorech a jak tedy umožnit zvýšení dávky bez nežádoucích účinků, se věnují celé vědecké týmy na prestižních pracovištích po desítky let a jedná se, pochopitelně, o sen onkologů od počátků chemoterapie v dobách Sidneyho Farbera a Emilů Freie. CuEt to dělá, aspoň u myší, sám od sebe. Zatím nevíme, proč tomu tak je.

V roce 2013 J. Bártek zahájil spolupráci s dánskými epidemiology. Cílem bylo využití celonárodních dánských registrů, z nichž bylo možné vyčíst, zda alkoholici, kteří brali antabus a zároveň měli nádorové onemocnění, měli lepší prognózu než jiní onkologičtí pacienti. Brzy se ukázalo, že není možné srovnávat alkoholika s rakovinou s onkologickým pacientem, který není alkoholik. Alkoholici mají horší prognózu vývoje nádorového onemocnění už jen proto, že jsou alkoholici. Nakonec bylo nutno srovnávat alkoholiky, kteří v době zjištění onkologické diagnózy přestali brát antabus, s těmi, kteří v tom pokračovali. Výsledek po mnoha náročných námitkách ze strany oficiálního oponenta, specialisty na epidemiologii, našeho článku, byl přesvědčivý ve prospěch protinádorového účinku antabusu. Nicméně od začátku jsme článek strukturovali tak, že tato epidemiologická studie byla výchozím bodem narativu, nikoli konečným. Epidemiologické výsledky položily otázku, zda je možné je zdůvodnit biologicky, tedy experimenty na myších a buňkách. Během recenzního řízení (článek byl poslán do Nature 1. října 2015 a byl akceptován 8. listopadu 2017) bylo pak mimo jiné jasně ukázáno, že samotný CuEt, pokud je aplikován u myší s tumory, má protinádorové účinky, čímž se rozptýlily poslední zbytky pochyb, zda při použití kombinace disulfiramu s měďnatými ionty přece jen za výsledný efekt na velikost tumorů nenesou zodpovědnost ještě nějaké další metabolity disulfiramu.