Aktuální číslo:

Kryptobiotické stavy aneb Vratná zastavení životních dějů

2. Když se příliš ochladí – kryobióza

| 11. 6. 2009

| Vesmír 88, 368, 2009/6

| Seriál: Kryptobióza, 2. díl (Předchozí – Následující)

Klesá-li teplota, zpomaluje se pohyb částic a s ním všechny biofyzikální děje. Snižuje se energie částic a jejich schopnost vstupovat do biochemických reakcí. Je tedy možné, aby se při určité teplotě život zcela zastavil? Jistěže ano. Je však možné, aby po následnémzvýšení teploty život opět pokračoval? A stává se to živočichům v podmínkách zemské biosféry? Pokud ano, tak jaké fyziologické adaptace jim to umožňují?

Podobné otázky si klade teoretická kryobiologie. Praktická kryogenika potom navazuje vývojem technologií pro skladování biologického materiálu za nízkých teplot. Ačkoli předmět obou vědních disciplín vypadá jako velmi jednoduchý, kryobiologie má v současnosti více otázek než odpovědí a kryogenika je, přes všechny úspěchy, dosud daleko od svých cílů, jakými jsou dlouhodobé uchovávání tkání, orgánů nebo celých organismů. Kromě toho existuje také kryonika, která se zabývá ukládáním mrtvých lidských těl do kapalného dusíku, ¹⁾ a proto ji skeptičtější vědci považují spíše za způsob pohřbívání než za seriózní vědu.

Účinky nízkých teplot na biologické systémy

Zřejmě hlavní překážkou pro rychlejší postup kryobiologické teorie a kryogenické praxe je fakt, že nízké teploty působí v organismu na mnoho různých „cílů“ zároveň. Každá částice nebo molekula mění svou kinetiku a energetický stav. Změna teploty se dotkne každé biologické struktury a každého procesu. Vícesložkové proteiny se rozdělí na jednotlivé části již za teplot kolem 0 °C a nižší teploty mohou způsobit nevratnou denaturaci neboli přechod z funkčního do nefunkčního prostorového uspořádání. ²⁾ Rovněž biologické membrány přecházejí z funkční fluidní fáze do nefunkční fáze gelové, ³⁾ podobně jako voda krystalizuje na led (viz rámeček Nízké teploty a voda 1 ).

Mnozí živočichové přežívají v hypotermním nebo kryotermním stavu, nikoli v kryobióze

Hypotermní a kryotermní stavy se rozhodně nekryjí s kryobiózou. Například některé antarktické ryby vedou plně aktivní, a přitom zcela kryotermní život za stálé teploty –1,9 °C. Definici kryobiózy (úplného zastavení metabolismu) nenaplňují ani zimní spáči čili hibernující savci. Jejich hypotermní metabolismus je sice hodně zpomalen, ale stále probíhá i za nejnižších tělních teplot, které se mohou pohybovat blízko 0 °C. Ani mezi studenokrevnými obratlovci nenajdeme žádné skutečné kryobionty. Ryby, obojživelníci a plazi sice během přezimování upadají do stavu strnulosti, ale jejich tělní teplota jen zřídka a krátkodobě klesá na kryotermní hodnoty. Pozoruhodnou skupinku tvoří několik druhů žab, mloků, želv a některé populace ještěrky živorodé, které během kryotermních epizod dokonce tolerují tvorbu ledu v tělních tekutinách. ⁴⁾

Zmrzlé žáby

Skokan lesní (Rana sylvatica) obývá sever Ameriky až po polární kruh. Je obratlovčím modelem pro studium přežití v částečně promrzlém stavu a zároveň i obratlovčím rekordmanem v této disciplíně. Dokáže přežít až dva týdny při tělní teplotě –5 až –6 °C; přitom je 65–70 % jeho tělní vody přeměněno v led. ⁵⁾ Úspěšné přežití je podmíněno dvěma jednoduchými, avšak zcela podstatnými předpoklady: led se musí vytvořit v mimobuněčném prostoru za poměrně vysokých teplot (nehluboko pod rovnovážným bodem mrznutí) a ochlazování musí být pomalejší než –0,2 °C za hodinu.

Klíčem k přežití skokanů, ale i jiných organismů (až na pár speciálních výjimek), je zabránit tvorbě ledových krystalů v buňkách. Rostoucí krystal by se tam totiž choval doslova jako slon v porcelánu. Skokani přezimují ve vlhkém prostředí, obklopeni ledovými krystaly. Okolní led snadno proniká kožními póry nebo tělními otvory a vyvolá krystalizaci nejprve v mimobuněčném prostoru. Na kůži žab a také v jejich střevě byly nalezeny bakterie, které na svém povrchu nesou tzv. nukleační proteiny. Ty slouží jako matrice, na níž vzniká krystalová struktura ledu – a jsou tak dalšími nukleátory ledu v mezibuněčném prostoru.

Pokud se led tvoří za poměrně vysoké teploty, nevzniká jej mnoho. Je soustředěn nejprve pod povrchem kůže, v břišní dutině, močovém měchýři a ve střevě. Jak krystalky ledu postupně rostou, mimobuněčný roztok se koncentruje a osmoticky odsává vodu z nitra buněk. Vodné roztoky v buňkách a také krev se zahušťují, ale zůstávají nepromrzlé. Pomalé ochlazování dává čas nejen na osmotické přesuny vody, ale hlavně na ochranná opatření. Zahuštění mimobuněčného roztoku vede k aktivaci β-adrenergních receptorů na hepatocytech, k stimulaci tvorby cAMP ⁶⁾ a přes učebnicovou fosforylační kaskádu až k enzymatickému odštěpování molekul glukózy ze zásobního glykogenu. Koncentrace glukózy v krevní plazmě se zvyšuje z normální hladiny 1–5 mM až na 300 mM. Dosud nezamrzlý krevní oběh dopravuje glukózu do všech vnitřních orgánů. Glukóza vstupuje do buněk, zvyšuje osmotickou koncentraci cytosolu, a tak snižuje objem vody, který je z buněk odsáván. Množství vytvořeného ledu a stupeň dehydratace buněk jsou tak za určité teploty vždy nižší v přítomnosti glukózy než bez ní. A to je vlastně základní princip, který využívá i praktická kryogenika.

Při dalším poklesu teplot nakonec promrzá i skokanova krev, ustává nervová a svalová aktivita, zastaví se krevní oběh a buňky se dostávají do ischemického stavu (je přerušena dodávka kyslíku i živin a odvod zplodin). Ledová bariéra navíc brání difuzi kyslíku do nitra buněk. Ani v tomto stavu však není dosaženo limitů kryobiózy. V nepromrzlém, zahuštěném cytosolu buněk dál pomalu pokračuje běžný anaerobní metabolismus.

Přezimující hmyz

Skutečné kryobionty živočišné říše hledejme mezi hmyzem, jenž je schopen přežít jakýkoli teplotní extrém myslitelný v zemské biosféře (Vesmír 75, 669, 1996/12). Různé druhy hmyzu kupříkladu přezimují v centrální Aljašce pod odlupující se kůrou odumírajících smrků a osik, plně vystaveni teplotám klesajícím až na –55 °C. ⁷⁾ Z předchozího dílu víme, že pokud je z organismu odstraněna voda, hlavní problém je vyřešen. Anhydrobiotický organismus přežije téměř všechno, včetně zchlazení na teplotu kapalného helia. Četné druhy hmyzu však přezimují v plně hydratovaném stavu.⁸⁾ Takže se musí nějak vyrovnat s fázovým přechodem vody. Existují dvě možnosti jak to učinit, a hmyz využívá obě – většinou druhově specificky a výlučně, někdy však i jako alternativy. Buď je možné oddálit tvorbu ledu a udržet vodu v kapalném podchlazeném stavu, nebo tolerovat promrznutí, či je dokonce řízeně zahájit při poměrně vysokých teplotách.

První strategie je pravděpodobně rozšířenější. Malá velikost hmyzího těla snižuje pravděpodobnost vzniku zárodečného krystalu. Je ale potřeba zbavit se všech možných nukleátorů ledu, například vyprázdnit střevo a odstranit nukleační bakterie. U druhů s touto strategií běžně pozorujeme sezonní pokles bodu podchlazení až na –25 °C. Některé druhy hmyzu pak posunuly podchlazovací schopnost až za hranici teoretických limitů, téměř na –60 °C. I za těchto teplot v nich nalézáme kapalnou vodu a žádný led. Jak je to možné? Zaprvé jde o velmi malý objem, v němž se silně uplatňují kapilární vlivy při interakci vody s povrchy membrán a makromolekul. ⁹⁾ Zadruhé metabolismus hmyzu produkuje ohromující množství kryoprotektivních látek, jež působí stejně jako nemrznoucí směs, kterou motorista přidává na zimu do auta. Účinnou složkou motoristických nemrznoucích směsí typu Fridex je etylenglykol. Stejnou látku si na zimu ve svém těle vyrábí lýkožrout Ips acuminatus, a to v koncentracích až 3000 mM. To znamená, že zhruba pětinu své sušiny dokáže přeměnit na bio-Fridex. Rovnovážný bod mrznutí je tím snížen až na –7 °C a bod podchlazení až na –30 °C. ¹⁰⁾ Hromadění etylenglykolu je výjimečné, vlastně bylo pozorováno jen u zmíněného lýkožrouta. Běžnějším kryoprotektantem hmyzí říše je glycerol (v koncentracích až 5000 mM) a dále různé vícesložkové směsi, obsahující kromě glycerolu jednoduché cukry a od nich odvozené polyoly (viz rámeček Hmyzí kryoprotektanty 2 ). Dalším trikem hmyzu, jenž mu umožňuje udržet metastabilní podchlazený stav po dlouhou dobu, je biosyntéza speciálních proteinů (anti-freeze proteins, AFPs). Ty dokážou „obalit“ zárodečný krystal ledu a zabránit mu v dalším růstu. Funkčně podobné proteiny najdeme také u antarktických ryb.

Druhou strategii – toleranci promrznutí – jsme v umírněné podobě poznali u skokanů. Některé druhy hmyzu ji však dovedly k dokonalosti, tedy k schopnosti úplné kryobiózy při –196 °C. V principu platí totéž co pro žáby: důležité je zmrznout včas a pomalu. Včasnost zajišťují jednak led a sníh v prostředí a jednak biosyntéza proteinových nukleátorů ledu tělu vlastních. Běžná rychlost poklesu teploty v biosféře (a zvláště v mikroklimatu místa pro přezimování) je dostatečně pomalá. Poznámka o rychlosti se tak vztahuje hlavně na laboratorní experimenty. V roli kryoprotektantů se uplatňují stejné látky jako v případě podchlazení. Tentokrát je však jejich hlavním úkolem regulovat míru dehydratace buněk a zamezit jejich smrštění pod určitý kritický objem (podobně jako u skokanů).

Ať už jde o jedince podchlazené nebo promrzlé, za teplot kolem –60 °C mohou být již velmi blízko kryobiotickému stavu. Mobilita molekul je totiž omezena nejen nízkou teplotou, ale zároveň vysokou viskozitou buněčných roztoků, které mohou přecházet až do amorfní tuhé fáze. Žádná přesná měření metabolických rychlostí za podobných podmínek však nejsou k dispozici. A stále ještě nejsme u pracovních teplot kryogeniky.

Hmyzí kryobiont

Mušky druhu Chymomyza costata obývají sever Evropy, Asie a Ameriky a žijí i v České republice. Jejich larvy přezimují v dormantním stavu pod kůrou padlých stromů. Během přezimování jsou schopny se podchlazovat, ale přežijí i promrznutí. Jejich larvy naplňují kryogenický sen. Přestože mají plně vyvinuté orgány, dokážeme je postupně zchladit až na teplotu kapalného dusíku, ¹¹⁾ a to v plně hydratovaném stavu (obrázek 2). A larvy to přežijí! Podmínkou jejich úspěšné kryoprezervace je předchozí pomalá laboratorní aklimatizace. Během ní se mění struktura buněčných membrán a hromadí se potenciální kryoprotektanty a anhydroprotektanty – prolin a trehalóza. ¹²⁾

Možná čtenáři nepřipadá přežití jakési mušky v kapalném dusíku ničím zajímavé. Snad tedy po přečtení následujících řádků…?

Dokáže kryogenika napodobit úspěšné hmyzí kryobionty?

Technologické postupy kryoprezervace jsou zvládnuty již zhruba 50 let, ale pouze pro izolované živočišné buňky určitých typů, pro jednobuněčné organismy nebo pro časná stadia živočišných embryí. Přes tyto nesporné úspěchy kryogeniky se zatím příliš nedaří postoupit na úroveň tkání, natož celých organismů. ¹³⁾ Tkáně jsou složeny z různých typů buněk a ty mohou vyžadovat různé, navzájem těžko slučitelné kryoprezervační postupy. Specifickým problémem je kryoprezervace nebuněčné extracelulární matrix. Kryoprezervací bývá narušena její prostorová struktura, bez níž tkáň normálně nefunguje. Úspěch praktické kryoprezervace stojí a zároveň padá se schopností naplnit dva (zdánlivě) jednoduché předpoklady:

nalézt správné tempo zchlazení a opětovného ohřátí;
nalézt vhodnou směs kryoprotektantů, dostat ji do nitra buněk a pak zase ven.

Je-li tempo chlazení příliš nízké, buňky jsou příliš dlouho vystaveny nepříznivým vlivům – dehydrataci a zahuštění cytosolu. Je-li tempo naopak příliš rychlé, není čas na osmotické vyrovnávání a ledové krystaly vznikají i uvnitř buněk. Je prostě třeba chladit dostatečně rychle i pomalu zároveň. To ale někdy nejde. A navíc různé typy buněk vyžadují řádově rozdílná tempa chlazení (1–1000 °C · min^–1). A podobné je to s ohříváním.

Kryogenika testuje celou škálu různých kryoprotektantů. Vhodný kryoprotektant se vyznačuje nízkou cytotoxicitou a snadným průchodem přes membránu, a tedy možností mnohonásobně zvýšit jeho koncentraci v buňce. Využívá se jak glycerolu a etylenglykolu, tak i několika dalších nízkomolekulárních kryoprotektantů, které se v přírodě nevyskytují (např. dimetylsulfoxidu). ¹⁴⁾ Vysokomolekulární kryoprotektanty (např. dextran či hydroxyetylovaný škrob) se někdy přidávají kvůli svým schopnostem ovlivňovat tvorbu ledu vně buněk a zmírňovat poškození způsobené rychlým chlazením.

Ve světle všech zmíněných potíží kryogeniky vypadají schopnosti larev chymomyzy jako sen. Je to ale skutečnost, jejíž podrobná analýza může napomoci při vývoji kryogenických aplikací.

Poznámky

1) Viz např. www.cryonics.org.

2) Privalov P. L.: Cold denaturation of proteins, CRC Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25, 281–305, 1990.

3) Chapman D.: Phase transitions and fluidity characteristics of lipids and cell membranes. Quart. Rev. Biophys. 8, 185–235, 1975.

4) Storey K. B., Storey J. M.: Physiology, Biochemistry, and Molecular Biology of Vertebrate Freeze Tolerance: The Wood Frog, in: Fuller B. J. et al. (eds.): Life in the Frozen State, Boca Raton, CRC Press, 243–274, 2004.

5) www.units.muohio.edu/cryolab/projects/WoodF....

6) cAMP = cyklický adenosinmonofosfát.

7) Miller K.: Cold-hardiness strategies of some adult and immature insects overwintering in interior Alaska, Comp. Biochem. Physiol. 73A, 595–604, 1982.

8) Holmstrup M., Westh P.: Dehydration of earthworm cocoons exposed to cold: a novel cold hardiness mechanism, J. Comp. Physiol. B 164, 312–315, 1994.

9) Liu D. et al.: Observation of the density minimum in deeply supercooled confined water, Proc. Natl. Acad. Sci. 104, 9570–9574, 2007.

10) Gehrken U.: Winter survival of an adult bark beetle Ips acuminatus Gy11, J. Insect Physiol. 30, 421–429, 1984.

11) Moon et al.: Cryopreservation of Chymomyza larvae (Diptera: Drosophilidae) at-196C with extracellular freezing, Cryo-Letters 17, 105–110, 1996.

12) Shimada K., Riihimaa A.: Cold-induced freezing tolerance in diapausing and nondiapausing larvae of Chymomyza costata (Diptera: Drosophilidae) with accumulation of trehalose and proline, Cryo-Letters 11, 243–250, 1990. Košťál et al.: Remodelling of membrane phospholipids during transition to diapause and cold-acclimation in the larvae of Chymomyza costata (Drosophilidae), Comp. Biochem. Physiol. 135B, 407–419, 2003.

13) Pegg D. E.: The current status of tissue cryopreservation, Cryo-Letters 22, 105–114, 2001.

Nízké teploty a voda

Nejnižší teplotu biosféry, –89,2 °C, zaznamenali 21. června 1983 na ruské antarktické stanici vostok. Kryoprezervace sensu stricto vyžaduje uložení za teplot pod –139 °C, kdy se zastavují všechny fyzikální změny krystalů ledu. Běžnou pracovní teplotou kryogeniky je teplota kapalného dusíku: –196 °C. Nejnižší fyzikálně možnou teplotou je absolutní nula (0 k = –273,15 °C), k níž se blíží například teplota kapalného helia: –270 °C.

Od jaké hodnoty ale mluvíme o nízkých tělních teplotách, o hypotermním stavu? Z pohledu běžné biologie jde o teploty pod prahem aktivity, růstu nebo vývoje organismu. pro teplokrevné živočichy začíná oblast nízkých teplot těsně pod nastavenou tělní teplotou (například 37 °C u člověka). Studenokrevní živočichové obvykle nemají tak přísné nároky a mnozí aktivně žijí i za teplot blízkých nule. Ryby a mořští bezobratlí, kteří obývají oceán v okolí antarktidy, dokonce stráví celý život ve vodě studené –1,9 °C.

Snížení tělní teploty na 0 °C nikdy neznamená fázovou změnu tělní vody (krystalizaci, mrznutí). V tělních roztocích jsou rozpuštěné částice, které snižují rovnovážný bod mrznutí o 1,86 °C na každý jeden osmol na kilogram. Typická osmolalita tělních tekutin téměř všech obratlovců a také suchozemských bezobratlých je okolo 300 miliosmolů na kg, a proto mají rovnovážný bod mrznutí posunut na hodnotu okolo –0,55 °C. Živočichové s tělní teplotou nižší, než je rovnovážná teplota krystalizace tělních tekutin, se nacházejí v kryotermním stavu. ani po dosažení této teploty však tělní tekutiny většinou nemrznou. Voda má schopnost existovat v metastabilním podchlazeném stavu až do teploty –38 °C (teplota homogenní nukleace).

Tělní voda tedy začíná mrznout někde mezi –0,5 a –38 °C. Jakmile se zformuje zárodečný krystal, poslouží jako nukleační jádro, k němuž se rychle připojují další molekuly vody. Projeví se to náhlým uvolněním skupenského tepla, jež můžeme snadno měřit jako reálný bod mrznutí (neboli bod podchlazení). Za jaké teploty přesně dojde k promrznutí, to závisí na osmolalitě vodného roztoku (každý jeden osmol · kg^–1 snižuje bod podchlazení o 2–4 °C), dále na objemu (pravděpodobnost zformování zárodečného krystalu je vyšší ve vyšším objemu), čase (čím déle v určité teplotě, tím vyšší pravděpodobnost krystalizace), a zejména na přítomnosti nukleačních faktorů – částic nebo povrchů, které katalyzují formování zárodečných krystalů. Jestliže pokles teploty pokračuje, stále větší podíl tělní vody se mění v led, přičemž voda „vázaná“ v hydratačních obalech molekul je odolnější vůči krystalizaci nežli voda „volná“.

Hmyzí kryoprotektanty

Hmyz přezimující v podchlazeném stavu v mírném pásmu velmi často hromadí směsi cukrů a polyolů (řádově stovky miliosmolů na kg). Takové množství nijak významně nesníží bod podchlazení. Přesto zvýšená koncentrace těchto látek většinou dobře koreluje se schopností přežívat v chladu. V naší laboratoři jsme prokázali, že i malé množství kryoprotektantů může zlepšit odolnost vůči chladu, avšak jiným způsobem. Nesnižuje bod podchlazení vody, ale patrně chrání funkční prostorové uspořádání proteinů a biologických membrán.