Cyklická adenozíndifosfát-ribóza

Existuje mnoho chemických látok, ktoré v organizme sprostredkúvajú výmenu informácií medzi bunkami. Niektoré, napr. steroidné hormóny, putujú z miesta svojho vzniku krvnými cievami k cieľovým bunkám, prenikajú cez ich bunkovú membránu, cytoplazmu i cez membránu jadra a priamo v jadre ovplyvňujú expresiu genetickej informácie.

Častejší je ale iný spôsob prenosu informácií medzi bunkami. K jeho objaveniu viedla približne pred štyridsiatimi rokmi identifikácia CYKLICKÉHO AMP (cAMP) ako sprostredkovateľa účinku adrenalínu na metabolizmus glykogénu. Na rozdiel od predošlého prípadu informačná molekula, „prvý posol“, konkrétne hormón adrenalín, nepreniká do bunky, ale sa viaže na špecifické receptory na povrchu bunkovej membrány. Po naviazaní adrenalínu na receptory sa začne syntetizovať DRUHÝ POSOL, t.j. látka, pomocou ktorej sa informácia šíri vnútri bunky. Druhým poslom je v tomto prípade cAMP. Zvýšená koncentrácia cAMP aktivuje enzýmy proteínkinázy, ktoré katalyzujú fosforyláciu cieľových bielkovín a zahajujú tak signalizačnú kaskádu, vedúcu k dlhotrvajúcej premene bunkových funkcií.

Ďalšou látkou s úlohou druhého posla je CYKLICKÝ GMP (cGMP). Takisto plní významnú funkciu v bunkovej signalizácii a v porovnaní s cAMP má rôznorodejší biologický účinok. Okrem toho, že aktivuje špecifickú kinázu, reguluje tiež fosfodiesterázu, enzým štiepiaci cyklické nukleotidy, a má priamy vplyv na funkciu sodíkového kanála.

Mnohé mimobunkové stimuly, ako sú hormóny, neuromediátory a rastové faktory, však nepôsobia prostredníctvom cyklických nukleotidov, ale prenášajú svoju informáciu zvyšovaním vnútrobunkovej koncentrácie voľného vápnika (Ca²⁺). Tento nárast je považovaný za univerzálny bunkový regulátor a predstavuje pre bunku významný signál. Vápnik je teda ďalším druhým poslom. Do bunky môže VÁPNIK vniknúť z vonkajšieho prostredia, alebo môže byť mobilizovaný z tzv. vnútorných zdrojov, napr. z endoplazmatického retikula (ER). Mobilizácia Ca²⁺ z týchto zdrojov má podstatný význam pre rôzne biologické pochody, počnúc oplodnením vajíčka, cez delenie bunky, morfogenézu, až po svalovú kontrakciu a sekréciu.

Mechanizmus uvoľnenia vápnika z bunkových kompartmentov

Tento mechanizmus je už v súčasnosti dobre preskúmaný a je zabezpečený dvoma cestami.

Prvá cesta je závislá na inozitoltrifosfáte (IP₃) a je v princípe podobná ceste, ktorou vykonáva svoj biologický účinok cAMP. Aj v tomto prípade bunka po aktivácii povrchového receptora produkuje druhý posol – fosforylovaný metabolit inozitolu – IP₃. Tento difunduje až na membránu ER a tam sa viaže na svoj receptor, ktorý je spojený s kanálom transportujúcim vápnik. Výsledkom je uvoľnenie Ca²⁺ do cytoplazmy, a teda zvýšenie jeho koncentrácie vnútri bunky.

Druhá cesta uvoľnenia Ca²⁺ je podľa mechanizmu nazvaná vápnikom indukované uvoľniene Ca²⁺ a je sprostredkovaná receptorom citlivým na rastlinný alkaloid ryanodín. Tento receptor je súčasne kanálom pre transport vápnika, pričom jeho regulácia cez nejaký špecifický signál je menej jasná.

Stále viac údajov nasvedčuje tomu, že CYKLICKÁ ADP-RIBÓZA (cADPR) funguje ako mobilizátor vápnika prostredníctvom spomínanej druhej cesty. Nie neopodstatnene sa teda uvažuje o tom, že práve cADPR môže byť fyziologickým regulátorom ryanodínového receptora a môže predstavovať novú cestu pre reguláciu vnútrobunkovej koncentrácie Ca²⁺.

Prirodzený nukleotid cADPR bol objavený v roku 1987 v laboratóriách dr. Leea na Minnesotskej univerzite (USA) vo vajíčkach morskej ježovky. Jeho koncentrácia v rôznych orgánoch bezstavovcov (bezobratlých) a cicavcov dosahuje pikomolárne hodnoty na mg bunkového proteínu. Na rozdiel od iných cyklických nukleotidov, nielenže cADPR nie je derivátom nukleozidtrifosfátov (je syntetizovaný z NAD⁺), ale predstavuje tiež nový typ cyklickej štruktúry. Týmto sa skupina cyklických nukleotidov rozširuje o novú štruktúru a súčasne aj o nový mechanizmus, ktorým posol informáciu prenáša. Kým cAMP a cGMP spúšťajú v bunke fosforyláciu bielkovín, účinkom cADPR po aktivácii receptora je mobilizácia Ca²⁺ z vnútorných zdrojov.

Syntéza a degradácia cADPR v bunke

Chemická štruktúra cADPR a známych cyklických druhých poslov cAMP a cGMP je znázornená na obrázku. Po purifikácii vysokotlakovou kvapalinovou chromatografiou a na základe RTG štruktúrnej analýzy sa dokázalo, že cyklizácia molekuly nastáva na atóme N1 adenínu. Molekula nie je rovinná a obe glykozidové väzby sú v β-konfigurácii, podobne ako u molekuly NAD⁺. Keďže však adenín má oproti ribóze tzv. syn konfiguráciu a táto je opačná ako v prípade NAD⁺, enzým syntézy cADPR musí byť iný ako enzýmy, ktorých substrátom je NAD⁺, napr. laktátdehydrogenáza.

A naozaj, hoci cADPR vzniká z NAD⁺, jeho syntéza je katalyzovaná špecifickým enzýmom ADP-ribozyl-cyklázou (ADPR-cykláza). Molekula enzýmu má molekulovú hmotnosť 29 000, stechiometricky premieňa NAD⁺ na cADPR a ako vedľajší produkt uvoľňuje nikotínamid. ADPR-cykláza nevyžaduje žiadny kofaktor a ako substrát môže čiastočne využiť aj NADH. Porovnaním aminokyselinovej sekvencie bolo dokázané, že tento enzým má 86 z 285 aminokyselín identických s jedným z antigénov ľudských lymfocytov.

Ak predpokladáme, že cADPR je skutočným druhým poslom, jej vnútrobunková koncentrácia musí byť pod kontrolou extracelulárneho stimulu pôsobiaceho na bunkovom povrchu a musí existovať cesta, ktorá ukončuje jej účinok. Degradačná cesta bola skutočne dokázaná a je katalyzovaná cADPR-hydrolázou – enzýmom, ktorý štiepi väzbu medzi N1 adenínu a ribózou. Tento enzým je prítomný vo vysokých koncentráciách najmä v mozgovom tkanive.

Úloha cADPR v signalizačnej ceste

Na základe analógie s fosfatidylinozitolovou cestou môžeme predpokladať, že enzým syntetizujúci cADPR, podobne ako fosfoinozitidáza C (fosfolipáza C), by mal byť regulovaný priamo alebo nepriamo aktiváciou receptorov na povrchu bunky. Priama regulácia nebola doteraz dokázaná. Kandidátom pre sprostredkovanú regulačnú funkciu, ako to vyplýva z pokusov na vajíčkach ježovky, je molekula cGMP. Guanylát-cykláza, enzým produkujúci cGMP, je stimulovaná novým typom posla (messengera) – oxidom dusnatým (NO) –, ktorý sa tvorí ako odpoveď bunky na primárny podnet po aktivácii povrchových receptorov. Keďže ADPR-cykláza je aktivovaná mechanizmom závislým od cGMP, zvýšenie koncentrácie cGMP, ktoré je nepriamym dôsledkom stimulácie povrchového receptora spriahnutého s produkciou NO, spôsobí zvýšenie cytoplazmatickej koncentrácie cADPR a spúšťa uvoľnenie Ca²⁺ z vnútorných zdrojov. Týmto mechanizmom može byť vysvetlený aj doteraz presne nepoznaný jav tzv. Ca²⁺ oscilácií, t.j. cyklického zvyšovania koncentrácie Ca²⁺ v bunke vo forme vľn. Dve látky zo skupiny cyklických nukleotidov, cGMP a cADPR, spolu s NO sa takto stávajú hlavnými hráčmi novej Ca²⁺ signalizačnej cesty, ktorej nuansy zostávajú ešte stále zahalené rúškom tajomstva.

Doterajšie pokusy nasvedčujú tomu, že receptorom pre cADPR nie je priamo ryanodínový receptor, ale susedná bielkovina s molekulovou hmotnosťou 140 000, ktorá s vysokou afinitou viaže cADPR a je schopná interakcie s Ca²⁺ kanálom (obrázek).

Uvoľnenie vápnika vyvolané cADPR bolo doteraz dokázané u bezstavovcov aj u cicavcov na systémoch ako sú vajíčka, bunky hypopofýzy, bunky dorzálnych ganglií, β-pankreatické bunky, či srdcové sarkoplazmatické retikulum. Úloha cADPR v bunkovej fyziológii nie je ešte presne známa a o jej regulačnej funkcii sa uvažuje najmä pri procesoch oplodnenia vajíčka, či pri regulácii sekrécie inzulínu v β-bunkách pankreasu.

Neočakávaný objav nového cyklického druhého posla sľubuje preto ešte určite veľa nových pozoruhodných zistení.