Petr Cígler: Partitury pro nanodiamanty

Zničili jsme mikrovlnnou troubu. Bylo to v roce 2004, pracoval jsem v redakci časopisu ABC a tehdejší postgraduální student VŠCHT Petr Cígler s kolegy připravil pro dětské čtenáře seriál chemických pokusů. Pokud vím, nikdo při jejich provádění nepřišel k úrazu, tedy až na onu mikrovlnku jednoho ze čtenářů, která padla za oběť nepozornosti při pokusu s imitací kulového blesku.

Petr své vlastní dětské pokusy také přežil bez úhony, přestože mnohé z nich by v ABC vyjít nemohly. „Koupil jsem si knihu Rudolfa Kouta Navedení k chemickým pokusům z r. 1906. Chemii obnažovala až na dřeň. Byly v ní pokusy se rtutí, s arzenem, s házením draslíku do kyseliny dusičné. Žádný jed nebyl pro autora dost jedovatý a žádná žíravina dost žíravá,“ vzpomíná.

Pokoj, který obýval spolu s mladším bratrem, proměnil v laboratoř. „Jednou se tatínek dost naštval, když zjistil, že topení je zrzavé jak liška. Doslova se z něj sypala rez. Asi jsem špatně zavřel lahev s kyselinou chlorovodíkovou nebo dusičnou. Představa, že jeho děti spí v atmosféře, která tak účinně koroduje topení, mu přišla poněkud nepatřičná, v čemž jsem mu musel dát za pravdu. Kyseliny jsem vystěhoval na balkon, ale laboratoř jela dál.“

Tisíc podob chemie

Snad každý chemik začínal s pokusy, při nichž to prská, syčí a bouchá. Ale chemie 21. století má více podob a Petr Cígler jich během své dosavadní vědecké kariéry vyzkoušel hned několik. Dnes vede výzkumnou skupinu syntetické nanochemie v Ústavu organické chemie a biochemie (ÚOCHB) a věnuje se věcem, které by Rudolfu Koutovi jistě připadaly jako sci‑fi.

Nanochemie se zabývá objekty velkými jednotky až stovky nanometrů, tedy 10^–9 až 10^–7 metru. To je měřítko příliš velké pro atomy a jednoduché sloučeniny, zároveň příliš malé pro částice pozorovatelné optickým mikroskopem. Patří sem agregáty menších molekul, makromolekuly včetně bílkovin a DNA, viry, subbuněčné struktury… „Mnohé fyzikální a fyzikálně-chemické principy fungují výhradně v této oblasti a nemají žádnou analogii,“ vysvětluje Petr Cígler, který hledá způsoby, jak tyto unikátní vlastnosti využít, třeba k diagnostice a léčbě rakoviny. Jejich rozměry a vlastnosti je předurčují například k roli senzorů či chirurgických nástrojů operujících uvnitř buňky.

Jeho cesta do nanosvěta ale nebyla přímočará. „Vždy jsem dělal trochu něco jiného, než co jsem zrovna studoval,“ říká. Začínal jako anorganický chemik, ale už téma jeho diplomové práce, týkající se komplexů organických sloučenin s kovy, ho přivedlo k organické syntéze a analytické chemii, která ho nadchla. Počítal s tím, že podobnému tématu, snad vývoji senzorů pro kovy, se bude věnovat i během doktorského studia. Ale všechno bylo jinak. „Mám pro vás daleko zajímavější téma. Inhibitory enzymů,“ zaskočil ho jeho školitel Vladimír Král.

„Nikdy jsem nic takového nedělal a ani jsem to neměl v úmyslu. Ale analytická chemie v tom byla také, měl jsem vyvinout metodu pro měření rezistence, tedy schopnosti enzymů odolávat vazbě inhibitorů. Přišlo mi to zajímavé, i když bylo jasné, že se toho budu muset hodně naučit,“ vzpomíná Cígler.

Začal se tedy zabývat inhibitory HIV proteázy – enzymu, bez kterého není virus HIV schopen dokončit svůj vývoj. Během dvou let syntetizoval stovky látek, ale stále nefungovaly tak, jak s kolegy předpokládal. Na enzym se vázaly jen slabě.

Šťastné náhody

„Byl jsem v půlce doktorátu a neměl jsem v ruce skoro nic. Začínal jsem už pomalu uvažovat o jiných cestičkách, kterými se vydat. Ale potom jsem poprvé v životě zažil to, čemu se anglicky říká serendipity. Šťastnou náhodu, na niž ale člověk musí být připraven, aby ji využil.“

Ve skupině prof. Krále jiní badatelé pracovali se skupinou sloučenin zvaných metalakarborany. Používaly se na něco úplně jiného, ale jejich tvar a vlastnosti naznačovaly, že by se mohly na HIV proteázu vázat. Ve spolupráci se skupinou Jana Konvalinky na ÚOCHB provedli potřebné testy a úspěch se dostavil, přestože tomu zpočátku nikdo nechtěl věřit. Následovala spolupráce s Ústavem anorganické chemie AV ČR, z níž vzešly průlomové práce včetně článku v prestižním časopise PNAS.¹⁾ Objev dosud neznámých inhibitorů HIV proteázy byl zkrátka velká věc.

Jenomže metalakarborany měly jednu zvláštní vlastnost: „Zjistili jsme, že jejich inhibiční účinek nezávisí lineárně na jejich koncentraci. Bylo nám to divné, tak jsme s kamarádem a spolužákem Pavlem Matějíčkem z PřF UK pátrali po příčině a zjistili jsme, že v roztoku vytvářejí agregáty.“ Pro využití ve farmakologii je to vlastnost velmi nepříjemná. Když si Petr Cígler stěžoval Vladimíru Královi na svou smůlu a ptal se ho, co si s tím počít, dostalo se mu stručné odpovědi: „Především o tom napište článek, je to přece nová věc.“ Zrodil se další nečekaný objev.²⁾ A patálie s agregujícími metalakarborany navíc Petru Cíglerovi otevřela cestu k nanochemii, protože agregáty spadají svými rozměry právě tam. Díky tomu na konferenci vyslechl přednášku jistého amerického profesora, který hovořil o tom, k čemu všemu jsou nanočástice dobré. „Jeho nanočástice byly úplně jiné než ty naše, byly to proteinové kapsidy virů, a mne to zcela nadchlo. Začal jsem si pohrávat s myšlenkou, že bych se něčemu takovému mohl do budoucna věnovat.“

Krystal z virů, zlata a DNA

Když hledal, kam by mohl po ukončení doktorského studia zamířit, narazil na M. G. Finna, který se v kalifornském The Scripps Research Institute v La Jolle u San Diega zabýval právě chemickou modifikací virových kapsid. Domluvili se a český student (v té době ho teprve čekala obhajoba doktorátu) se stěhoval do Kalifornie.

Naučil se tam pracovat s viry a vkládat do proteinů syntetizovaných bakteriemi syntetické aminokyseliny vybavené reaktivní skupinou, která slouží jako molekulární konektor. Lze k ní připojit další molekuly a konstruovat tak složité struktury mající tvar a další vlastnosti šité na míru různým potřebám.

Nejviditelnějším výsledkem byl článek v časopise Nature Materials,³⁾ v němž Petr Cígler coby první autor s kolegy popsal přípravu nekompaktní krystalové mříže tvořené upravenými virovými kapsidami a zlatými nanočásticemi spojenými molekulami DNA. Vznikl tak prototyp samoskladného fotonického krystalu, který selektivně propouští jen určité vlnové délky. Filtrovat různé části elektromagnetického spektra není v makroskopickém měřítku nic těžkého, ale v nanosvětě se to do té doby dařilo jen obtížně. Výzkum ukázal cestu např. k výrobě součástek pro budoucí kvantové počítače. Nebylo přitom nutno skládat krystal vrstvu po vrstvě. Molekuly DNA s přesně definovanou sekvencí bází jednoznačně determinovaly způsob, jakým se jednotlivé komponenty poskládají.

Diamantové lucerničky

Bylo jasné, že i po návratu do České republiky se bude věnovat nanočásticím. Nastoupil na ÚOCHB, kde od roku 2013 vede vlastní výzkumnou skupinu. Jedním z hlavních předmětů jeho zájmu jsou nanokrystaly diamantu a možnosti jejich využití v lékařské diagnostice a terapii.

Nanodiamanty mohou být za určitých podmínek fluorescenční. Po ozáření zeleným světlem vyzařují světlo v blízké infračervené oblasti (okolo 700 nm), které snadno proniká biologickými tkáněmi a lze ho pozorovat fluorescenčním či konfokálním mikroskopem. Pokud jsou nanodiamanty navrženy tak, aby se vázaly na specifické biologické struktury, poslouží jako „lucerničky“, umožňující tyto struktury lokalizovat. Díky tomu je možno např. zobrazit mitochondrie uvnitř buňky nebo v tkáni rozpoznat buňky nádorového bujení.

Syntetické nanodiamanty si vědci kupují. „V hrubší verzi je lidé znají jako brusný materiál, my používáme např. frakci o rozměrech mezi 10 a 50 nm. Ale je to pro nás jen surovina. Asi jako když si zlatník koupí cihličku zlata. Následuje velké množství chemických a fyzikálních zásahů, než nanodiamanty upravíme do využitelné podoby.“

Koupené nanodiamanty předně nejsou fluorescenční. Tuto klíčovou vlastnost jim dodá až narušení jejich krystalové mřížky. Vysokoenergetické částice v cyklotronu Ústavu jaderné fyziky v Řeži z nich vyrazí několik uhlíků, čímž v mřížce vzniknou „díry“ (vakance). Ty se poté při teplotách přesahujících 600 °C spárují s přítomnými nečistotami, atomy dusíku. Právě tato tzv. N–V centra (dusík–vakance) jsou zdrojem fluorescenčních vlastností. Cíglerův tým mimo jiné pracuje na vylepšení fluorescence, její intenzitu se mu podařilo ve spolupráci s dalšími laboratořemi řádově zvýšit.

Fluorescence nanodiamantu může být navíc ovlivněna děním na jeho povrchu. Chemické změny v bezprostřední blízkosti diamantu ovlivňují náboj N–V center, a tím i emisní maximum jejich fluorescence. Mění se tedy barva vyzařovaného světla. Lze toho využít ke sledování různých biochemických změn v buňce nebo k odhalení přítomnosti specifických molekul v okolí nanodiamantu.

Aby mohly být nanodiamanty použity jako biosenzory nebo například jako poslíčci dopravující na konkrétní místo v organismu léčivo, musí projít řadou dalších úprav. Je třeba je mimo jiné obalit vrstvou silikagelu (hydratovaného oxidu křemičitého) a další vrstvou z hydrofilního, biokompatibilního polymeru. Díky těmto obalům získají nanodiamanty tvar blízký kouli, sjednotí se jejich velikost, dostanou ochranu před imunitním systémem a lze na ně navázat další látky, které poslouží jako štítky s adresou určení. Selektivně se vážou na konkrétní buněčné struktury, takže fluorescenční značka označí jen to, co skutečně má, a případné léčivo doputuje pouze tam, kde je jeho působení žádoucí.

Najdi a znič

Jak už bylo řečeno, nanodiamanty lze využít i k cílené terapii. Kromě navázání léčiva se nabízí také využití zvláštních optických vlastností upravené částice. Diamant obalený silikagelem a tenkou vrstvičkou zlata totiž vykazuje díky kombinaci dielektrika a kovu plazmonické efekty: po ozáření laserem o vlnové délce 750 nm, který snadno proniká tkání, se světlo přemění na teplo.

„Když jsme poprvé připravili a testovali plazmonické nanodiamanty, umístili jsme se studentkou jejich inkoustově modrý roztok do poměrně málo výkonného laserového paprsku. V roztoku jsme měli teplotní čidlo a napjatě jsme očekávali, jestli budeme schopni pozorovat zvýšení teploty o několik stupňů. Místo toho roztok během několika sekund vyprskl z kyvety. Okamžitě nám bylo jasné, že máme v rukou něco mimořádného.“ Kolem osvícené částice se začne doslova vařit voda. Ohřeje se až na několik tisíc stupňů a vznikající nanobublinky vodní páry roztrhají biologické struktury do vzdálenosti stovek nanometrů. Pomocí těchto nanobomb tak lze efektivně zničit například nádorové buňky.

Kromě toho Petr Cígler se svým týmem rozvíjí další témata, jimž se věnoval na svých předchozích působištích. Zkoumá například využití virových kapsid a virům podobných částic jako konstrukčního nanomateriálu a nové inhibitory enzymů.

„Na tom, co děláme, mne moc baví multidisciplinarita. Chce-li se člověk věnovat nanočásticím využitelným v medicíně, musí znát anorganickou, fyzikální i analytickou chemii, organickou syntézu, mít povědomí o biochemii a molekulární biologii… Je nezbytné pořád se učit nové věci, což je sice náročné, ale fascinující.“ Dobře to ilustruje skutečnost, že Petr Cígler je v současné době školitelem na 1. LF UK v oboru biochemie a patobiochemie, na PřF v oboru anorganická chemie, na VŠCHT v oboru chemické inženýrství a na stejné škole působí také jako externí školitel v oboru anorganické chemie.