Aktuální číslo:

2018/10

Téma měsíce:

Navigace

Hmotnostní spektrometrie a velké molekuly

Ionizační metody analýzy biologických makromolekul
 |  5. 6. 2003
 |  Vesmír 82, 312, 2003/6

Nobelovou cenou za chemii byli r. 2002 oceněni tři vědci, kteří přispěli k vývoji metod pro analýzu biomolekul (viz též článek na s. 314). Polovina ceny, kterou získali Američan John B. Fenn a Japonec Koiči Tanaka, byla udělena za „vývoj měkkých ionizačních metod pro hmotnostní spektrometrickou analýzu biologických makromolekul“. Málokdy se stává, aby cenu sdíleli dva vědci, z nichž jeden je bezmála dvakrát tak stár než druhý – Johnu Fennovi je 85 let, K. Tanakovi jen 43.

Vývoj zmíněných analytických metod se týká způsobů převedení molekul biochemické a biologické důležitosti do plynné fáze v podobě iontů. Vzniklé ionty se dají analyzovat hmotnostním spektrometrem, lze určit jejich molekulovou hmotnost, popřípadě z jejich rozpadu dospět k závěrům o jejich struktuře. V poslední době se hmotnostní spektrometrie stala (i díky zmíněným vědcům) jedním z nejdůležitějších způsobů analýzy biologicky významných molekul.

Hmotnostní spektrometrie

Tato metoda využívá pohyb urychlených iontů v kombinaci elektrických a magnetických polí ve vysokém vakuu k zjištění hmotnosti příslušných molekul (přesněji poměru hmotnosti a náboje). Původní metoda byla vyvinuta už koncem 19. století. Anglický fyzik J. J. Thomson ji použil k analýze „pozitivních paprsků“ z výbojů a v popisu pozorovaných hmotností neonu podal první důkaz, že vedle izotopů radioaktivních prvků mohou existovat i stabilní izotopy (za vedení elektřiny ve zředěných plynech dostal r. 1906 Nobelovu cenu). Ve své monografii z r. 1912 zdůraznil obrovský význam hmotnostní spektrometrie pro chemii, zvláště pro chemii analytickou. Díky hmotnostní spektrometrii popsal F. W. Aston většinu stabilních izotopů a objevil také odchylky jejich hmotností od celistvých čísel (Nobelova cena mu za to byla udělena r. 1922). Od té doby byly hmotnostní spektrometrií účinně analyzovány směsi plynů nebo zplynitelných kapalin.

K ionizaci plynných směsí se používala metoda nárazu urychlených elektronů, což byla v polovině 20. století jedna z nejdůležitějších metod pro analýzu směsí uhlovodíku v ropném průmyslu. Od padesátých let minulého století nastal mocný rozvoj hmotnostní spektrometrie a jejích aplikací v nejrůznějších oblastech vědy. Zároveň se rozvíjely metody analýzy hmotnosti ionizovaných částic.

Původní přístroje využívaly kombinaci elektrických a magnetických polí, později byla vyvinuta zařízení (kvadrupolové analyzátory) založená na průchodu iontů vysokofrekvenčním střídavým elektrickým polem, popřípadě na jejich zadržení v tomto poli a postupném vypuzování podle rostoucí hodnoty poměru hmotnosti a náboje (analyzátory na principu iontové pasti). Při konstrukci hmotnostních spektrometrů se rovněž využívá pohyb iontů v kombinaci zkříženého střídavého elektrického pole s magnetickým polem (iontová cyklotronová rezonance či její obměna s Fourierovou transformací) a metody pulzní analýzy urychlených iontů podle doby průletu určité dráhy (průletové spektrometry, reflektron). S vývojem metody se neobyčejně zvýšila citlivost a rozlišovací schopnost hmotnostní analýzy. Oproti původnímu rozlišení iontů s hodnotami poměru hmotnosti a náboje lišícími se o jednotku lze dnes odlišit ionty, u kterých se rozdíl těchto hodnot pohybuje v tisícinách i v ještě menších hodnotách.

Počátkem šedesátých let 20. století se hmotnostní spektrometrie začala používat v organické chemii k analýze a objasnění struktury molekul. Ionizace molekuly sloužila nejen k určení molekulové hmotnosti, ale z rozpadů vzbuzené ionizované molekuly a z výskytu iontových druhů v hmotnostním spektru bylo možno zjistit, jakou strukturu měla původní molekula. V krátké době se metoda rozšířila z výzkumu organických látek na analýzu léčiv, metabolitů a biologicky významných látek s velkou hmotností. Původně používané metody ionizace par látek elektrony, fotony nebo jinými ionty však narážely na obtíže s převedením příliš velkých molekul do plynného skupenství, neboť když se látky zahřály na potřebnou vysokou teplotu, rozložily se.

Ionizace elektrosprejem

V roce 1988 publikoval John Fenn se spolupracovníky nový postup ionizace biomakromolekul, který v možnostech jejich studia znamenal převrat. Využil k tomu ionizaci elektrosprejem: Zředěný roztok analytu se v množství několika mikrolitrů za minutu zavádí velmi úzkou kapilárkou z vodivého materiálu do rozprašovací komůrky. Na kapiláru se vkládá vysoké napětí (v jednotkách kilovoltů), což způsobí, že se kapalina rozprašuje ve formě nabitého aerosolu. Rozpouštědlo se z povrchu aerosolových částic rychle odpařuje, hustota náboje stoupá, až dojde k výbuchu a vzniknou podstatně menší částice, z nichž se molekuly rozpouštědla vypařují ještě rychleji. Ve zředěné plynné fázi tak rychle vznikají ionty zbavené rozpouštědla. Přidávaný plyn pomáhá ionizovaným částicím zbavovat se rozpouštědla a také nadbytečné kinetické energie, a nakonec se systémem vakuových clon a štěrbinových elektrod vytvoří svazek iontů pro hmotnostně spektrometrickou analýzu. Metoda nachází uplatnění v analýze velmi složitých látek, jako jsou peptidy, proteiny, nukleové kyseliny a cukry. Vícenásobný náboj iontů nadto dovoluje analyzovat i pomocí jednoduchých spektrometrů látky o velmi vysoké molekulové hmotnosti, neboť měřený poměr hmotnosti a náboje je při velké hmotnosti, ale zároveň i náboji v rozsahu těchto přístrojů. Má-li např. dvacetinásobně nabitý ion (z = 20) relativní hmotnost m = 40 000, pak poměr hmotnosti a náboje m/z = 2000 zůstává v rozsahu měření jednoduššími přístroji (při jednonásobném nabití by hodnota m/z = 40 000 byla mimo jejich rozsah).

Vakuový instalatér

Stojí zato si povšimnout, že John Fenn své zásadní práce o metodě ionizace elektrosprejem publikoval v jednasedmdesáti letech. Byl v té době už od počátku šedesátých let profesorem Yaleovy univerzity v New Haven, na níž kdysi získal doktorát. V současné době je tento stále aktivní více než osmdesátník emeritním profesorem analytické chemie na Státní univerzitě ve Virginii. Váženým fyzikem byl už dříve. Zásadní význam měly jeho práce o přípravě „molekulových paprsků“ – tenkých řídkých proudů molekul pohybujících se nadzvukovou rychlostí ve vakuu. Mezi vědci zabývajícími se přípravou a použitím atomových a molekulových paprsků byl pokládán za nestora celé této oblasti. Získal řadu ocenění v USA i ve světě. Už dávno jej svým čestným členem jmenoval Výbor mezinárodní konference o molekulových paprscích (vyznamenání, jehož se dostalo jen několika vědcům na světě). On sám však veškeré pocty přijímal s charakteristickou skromností. „Jsem jenom vakuový instalatér,“ říkával při takových příležitostech.

Ionizace s přispěním matrice

Hlavní přínos podstatně mladšího K. Tanaky spočívá v aplikaci metody jemné laserové desorpce (SLD, soft laser desorption) k ionizaci velkých molekul, jako jsou proteiny (1987–1988). Ze skupiny ionizačních metod, které využívají opatrné zplynění pevného vzorku laserovým pulzem, je nejpodstatnější metoda MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization, viz např. Jan Havliš, Vesmír 78, 448, 1999), což je ionizace pomocí laserové desorpce s přispěním matrice. Vyvinuli ji a popsali F. Hillenkamp a M. Karas. Vzorek analyzované látky je zabudován do matrice nosné látky (Hillenkamp s Karasem používali organickou matrici na pevném povrchu, kdežto Tanaka používal kovový prášek v kapalné matrici). Krátký jemný laserový pulz ze směsi matrice a sledované látky přímo uvolňuje ionty, které je možno hmotnostně spektrometrickými metodami analyzovat. Podstata metod není zcela objasněna, účinnost ionizace velmi záleží na druhu nosné látky v matrici.

MALDI, SELDI a budoucnost

Dnes již existuje řada velmi účinných laserových ionizačních metod, spočívajících na jemné desorpci. Vedle MALDI jsou to SELDI (surface-enhanced laser desorption ionization), což je laserová desorpce zvýšená povrchem, DIOS (direct ionization on silicon), tj. přímá ionizace na křemíku, a další. Koiči Tanaka zveřejnil práce, za které se mu dostalo ocenění, ani ne jako třicetiletý. Jeho pracovní kariéra je svázána s firmou Šimacu, kde se dosud věnuje dalšímu vývoji hmotnostní spektrometrie.

K rozvoji hmotnostní spektrometrie a jejímu širšímu uplatnění přispěli oba vědci. Dnes tato technika nachází rozsáhlé využití například v diagnostice chorob, ve vývoji léčiv, ale i v kontrole potravin nebo třeba v analýze složek životního prostředí. Důležitou roli hraje také při výzkumu vesmíru.

Koiči Tanaka /* 3. 10. 1959, Tojama, Japonsko/


Je nejmladším laureátem Nobelovy ceny za chemii od roku 1967. V roce 1983 absolvoval Tóhockou univerzitu v japonském Sendai a 1. dubna téhož roku nastoupil jako výzkumný a vývojový inženýr do analytického oddělení Ústřední výzkumné laboratoře firmy Šimacu, kde působí dodnes. Tato firma, která má pobočky po celém světě, vyrábí a prodává různé měřicí a lékařské přístroje.

John Fenn /*1917, New York City, USA/


Roku 1940 získal doktorát na Yaleově univerzitě v New Haven v Connecticutu, počátkem šedesátých let se na téže univerzitě stal profesorem a od r. 1987 je emeritním profesorem. Deset let také pracoval v kosmickém výzkumu. Krátkodobě působil v Itálii na Tridentské univerzitě a v Japonsku na Tokijské univerzitě. Od roku 1994 žije a pracuje na Virginské státní univerzitě v Richmondu. Dostal řadu vyznamenání v USA i v Evropě, mimo jiné je čestným členem výboru mezinárodní konference o molekulových paprscích.

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Chemie
RUBRIKA: Nobelovy ceny

O autorech

Vladimír Hanuš

Zdeněk Herman

Karel Lemr

Doporučujeme

Vlaštovka extrémista

Vlaštovka extrémista

Jaroslav Cepák, Petr Klvaňa  |  10. 10. 2018
Díky satelitní telemetrii se podařilo odhalit vpravdě neuvěřitelné výkony některých ptačích druhů. Nejznámějším je zřejmě osmidenní nonstop let...
Velké umění astronavigace: Od astrolábu po sextant

Velké umění astronavigace: Od astrolábu po sextant

Petr Scheirich  |  1. 10. 2018
Staří mořeplavci prý určovali polohu své lodi podle hvězd. Tato rozšířená romantická představa je ale nesprávná. Metoda astronavigace nikdy nebyla...
Jak se neztratit na moři

Jak se neztratit na moři

Petr Scheirich  |  1. 10. 2018
Dle znamenitého pozorování Slunce a Měsíce shledávám naši zeměpisnou délku 178° 18' 30" západně od Greenwiche. Zeměpisná délka dle logu je 175°...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné