Kontrast v optické mikroskopii

Kvalitu zobrazení mikroskopických objektů charakterizují tyto parametry: zvětšení, rozlišovací schopnost mikroskopu a obrazový kontrast. Zvětšení mikroskopu je dáno součinem zvětšení objektivu a okuláru. Tento parametr je v podstatě nejméně důležitý, byť laiky zpravidla nejvíce přitahuje. Maximální zvětšení dosažitelné nejlepšími objektivy, které by bylo užitečné při vizuálním pozorování, je 500x až 1000x. Zvětšíme-li pomocí silnějšího okuláru obraz nad tuto mez, získáme jen prázdné zvětšení – to jest větší obraz bez jakýchkoli nových detailů.

Rozlišovací schopnost mikroskopu je shodná s rozlišovací schopností jeho objektivu. Úzce souvisí s tím, že ke vzniku obrazu přispívají difrakční jevy. Ideální bod se proto nezobrazí opět jako bod, nýbrž jako poněkud rozmazaná malá ploška. Při vizuálním pozorování a s nejkvalitnějšími objektivy je rozlišovací schopnost optických mikroskopů mírně lepší než polovina vlnové délky použitého světla. Samotná vynikající rozlišovací schopnost objektivu však ještě nezaručuje, že teoreticky rozlišitelné strukturní detaily v mikroskopickém obrazu skutečně uvidíme. Můžeme je spatřit jen tehdy, existuje-li dostatečný rozdíl jasu mezi nimi a jejich okolím.

Kontrast zobrazení je charakterizován poměrem rozdílu mezi jasem objektu a jasem pozadí k jasu tohoto pozadí. Pro strukturní elementy uvnitř objektů bude definice kontrastu samozřejmě mít trochu jinou podobu, což však pro nás není nijak významné. Primárním zdrojem kontrastu je interakce mikroskopických objektů s osvětlujícím zářením. Uplatnit se může:

• difrakce
• absorpce
• rozptyl světla
• ohyb světla
• lom světla
• dvojlom polarizovaného světla
• fluorescence

Nakolik se libovolný z vyjmenovaných jevů bude skutečně podílet na vzniku a kvalitě obrazu, to závisí na konstrukci mikroskopu. Na rozdíl od makroskopických objektů, které vidíme pouhým okem, nemívají proto obrazy mikroskopických objektů jedinou možnou podobu. Konkrétní vzhled mikroskopických objektů závisí zásadním způsobem na použité mikroskopické technice. Nebudeme se zabývat technikami kombinovanými s digitalizací a počítačovým zpracováním obrazů, jako jsou např. videomikroskopie, konfokální mikroskopie (viz Vesmír 74, 508, 1995/9) a rastrovací optická mikroskopie bez čoček.

Zobrazení ve světlém poli a pozorování absorbujících objektů

Pozorování ve světlém poli je základní mikroskopickou technikou. Světlo z kondenzoru prochází vzorkem a vstupuje do objektivu. Objekty vidíme díky tomu, že jsou schopny absorpcí zeslabovat intenzitu procházejícího záření. Tato metoda je proto vhodná jen pro objekty buď zcela nepropustné, nebo alespoň barevné. Příkladem barevných objektů jsou třeba chloroplasty nebo chitinový exoskelet hmyzu. Viditelnost většiny biologických preparátů je zpravidla třeba zlepšit barvením. Cytochemické a histochemické postupy umožňují specificky barvit nejrůznější biologické tkáně. Je ovšem třeba zdůraznit, že barvením se vedle základní informace o fyzické morfologii strukturních detailů zkoumaných objektů získává též informace o jejich chemickém složení.

Fluorescenční mikroskopie

Zvláštní skupinu mikroskopických barviv představují barviva fluorescenční, která při ozařování světlem vhodné vlnové délky reemitují část absorbovaného záření jako fluorescenci. Emise je spektrálně posunuta oproti excitačnímu záření směrem k větším vlnovým délkám. Existující fluorescenční barviva umožňují specifickou detekci buněčných organel, monitorování koncentrací intracelulárních iontů nebo po navázání na protilátky slouží k identifikaci receptorů na buněčných površích apod. Řada biologických objektů však obsahuje svá přirozená fluorescenční barviva (např. chlorofyl nebo karotenoidy).

Fluorescenční mikroskop se od obyčejného mikroskopu liší párem spektrálních filtrů. První z nich je součástí osvětlovací soustavy a slouží k vymezení vlnové délky budicího záření. Druhý je za objektivem a propouští jen emisi, budicí záření musí zadržet.

Pozorování neabsorbujících objektů

Aby bylo možné neabsorbující objekty pozorovat, musí se od svého okolí lišit alespoň indexem lomu, který spolu s jejich tloušťkou ovlivňuje fázi procházejícího světelného vlnění. Posun fáze není ovšem jediným optickým jevem, s nímž se u fázových objektů setkáváme. Na rozhraní mezi objektem a okolním prostředím dochází k odrazu a lomu světla. Malé strukturní detaily světlo rozptylují. Za určitých podmínek se může stát, že část zobrazujícího světla je takto vržena mimo objektiv a nemůže tudíž přispět ke zvýšení celkového jasu obrazu. Proto se např. stěny stélek, okraje buněk i kontury jiných nebarevných objektů při zobrazení ve světlém poli jeví tmavší než pozadí.

Metody pozorování fázových objektů lze trochu netradičně rozdělit do dvou kategorií. Do první spadají metody využívající různých forem šikmého osvětlení. Ty slouží především ke zvýraznění těch objektů a strukturních detailů, které výrazně mění směr šíření jimi procházejícího světelného záření. Patří sem pozorování v temném poli a Hoffmanův modulační kontrast. Do druhé skupiny náleží metody umožňující přímou detekci fázových posunů procházejícího světelného záření: fázový kontrast, interferenční mikroskopie, Nomarského diferenciální interferenční kontrast a polarizační mikroskopie.

Šikmé osvětlení

Šikmé osvětlení používal ke zviditelnění neabsorbujících objektů již Ernst Abbe koncem minulého století. Kondenzor mikroskopu musí být asymetricky zacloněn nebo excentricky nastaven, aby část světelného kužele, který z kondenzoru vystupuje, procházela mimo objektiv. To vede ke snížení jasu zorného pole mikroskopu. Objekty či jejich strukturní detaily, které ohybem, odrazem či rozptylem světla mění směr chodu paprsků tvořících tento kužel, se pak ve výsledném obraze jeví jako tmavší nebo světlejší než pozadí podle toho, zda část paprsků světelného kužele odchýlily ještě více mimo objektiv, nebo je naopak do objektivu nasměrovaly. Charakteristickým znakem obrazů získaných při šikmém osvětlení je jejich výrazná asymetrie. Vypadají jako šikmo nasvícené trojrozměrné objekty, na jedné straně světlé, na protější ponořené ve stínu. Popsaný vizuální efekt však zpravidla nemá mnoho společného s jejich reálnou prostorovou strukturou.

Při pozorování v temném poli je konstrukcí osvětlovací soustavy zajištěno, že do objektivu se dostane jen světlo, které interakcí se vzorkem pozměnilo směr šíření. Zorné pole je proto zcela tmavé a pozorované objekty září na temném pozadí. V temném poli lze snadno detegovat velmi malé objekty, včetně takových, jejichž rozměry jsou pod hranicí teoretické rozlišovací schopnosti mikroskopu. Pro seriózní studium valné většiny objektů se však pozorování v temném poli nehodí, neboť je při něm nadměrně zdůrazněn kontrast kontur a malých strukturních detailů.

Atraktivní variací temného pole je Rheinbergovo optické barvení, při němž je kondenzorová apertura a maska z transparentních optických filtrů, nejčastěji ve dvou různých základních barvách. Tak dosáhneme toho, aby se pozorované objekty objevily třeba v červené barvě na zeleném pozadí.

Hoffmanův modulační kontrast je v podstatě zdokonalenou verzí šlírové mikroskopie, při které je šikmého osvětlení dosaženo pomocí mimoosově umístěné štěrbinové apertury v přední ohniskové rovině kondenzoru. Kondenzor spolu s objektivem zobrazuje tuto štěrbinu do zadní ohniskové roviny objektivu, kde se v místě jejího obrazu nachází maska, která blokuje volný průchod osvětlujícího záření objektivem. Při prosté šlírové mikroskopii je tato maska z nepropustného materiálu a výsledek se podobá pozorování v temném poli. Při Hoffmanově modulačním kontrastu se objektivová maska skládá ze tří zón o různé propustnosti a výsledek je podobný zobrazení při obyčejném šikmém osvětlení s excentrickým kondenzorem.

Přímá detekce fázových posuvů

Fázový kontrast (F. Zernikovi byla za tento vynález r. 1953 udělena Nobelova cena) převádí fázové posuvy světelného vlnění, které prošlo vzorkem, na změny intenzity v obraze. Pomocí kondenzorové apertury měníme cíleným způsobem relativní fázový posuv mezi nedifraktovaným osvětlujícím zářením a částí světla, které při průchodu vzorkem změnilo nejen fázi, nýbrž i svůj směr šíření. Interference difraktovaných a nedifraktovaných složek pak vyjeví, jaký je relativní posuv fáze světla procházejícího vzorkem oproti světlu, které procházelo pozadím.

Při fázovém kontrastu se často používá kvazimonochromatického osvětlení žlutozelené barvy (na takové světlo je lidské oko nejcitlivější) a fázová maska zpožďující fázi difraktovaného záření o čtvrtinu vlnové délky. Fázové objekty pak vidíme jako tmavé na světlém pozadí, tím tmavší, čím je objekt silnější (pozitivní fázový kontrast). Fázovou masku je ale možno zhotovit i tak, že zpožďuje nedifraktované záření. Pozorované fázové objekty se pak jeví jako světlé na tmavším pozadí (negativní fázový kontrast). Pokud osvětlíme vzorek bílým světlem, bude jeho obraz zbarvený, neboť fázové poměry mezi interferujícím difraktovaným a nedifraktovaným zářením závisí ze zřejmých důvodů na vlnové délce.

Závažným nedostatkem fázového kontrastu je existence halo, což je jasně zářící rozhraní mezi objektem a okolním prostředím, které vzniká v důsledku lomu světla na stěnách mikroskopických objektů, zejména když jsou z materiálu o vysokém indexu lomu. Pokud se chceme vyhnout tomuto nepříjemnému efektu, musíme použít Hoffmanův modulační kontrast nebo Nomarského techniku.

Interferenční mikroskopie, Nomarského diferenciální interferenční kontrast. Při fázovém kontrastu necháváme interferovat difraktované záření s tím, které při průchodu vzorkem nezměnilo směr šíření, když jsme napřed důmyslným způsobem pozměnili jejich relativní fáze. Při klasické interferenční mikroskopii detegujeme fázové posuvy zobrazujícího záření pomocí jeho interference s referenčním paprskem, pro který je v interferenčním mikroskopu zvláštní dráha, oddělená od té, po které prochází světlo interagující se vzorkem. Interferenční mikroskopie se používá hlavně k absolutnímu měření hodnot fázových posuvů.

Diferenciální interferenční kontrast dle Nomarského umožňuje díky páru vložených Wollastonových hranolů a páru zkřížených polarizátorů interferenci světelných příspěvků, které přicházejí ze sousedních míst vzorku, vzdálených od sebe o méně, než činí rozlišovací schopnost mikroskopu. Takto se zviditelní oblasti, kde existují gradienty optické dráhy zobrazujících paprsků (optická dráha je součinem geometrické tloušťky a indexu lomu objektu). Zobrazení fázových objektů Nomarského metodou se velice podobá tomu, co můžeme vidět pomocí obyčejného šikmého osvětlení nebo pomocí Hoffmanova modulačního kontrastu. Stejné gradienty optické dráhy se však zpravidla vyjeví s podstatně lepším kontrastem. Díky užití zkřížených polarizátorů se Nomarského mikroskop současně chová i jako obyčejný polarizační mikroskop, v němž anizotropní objekty s dvojlomem jasně září na temném pozadí. Tato skutečnost někdy příznivě přispívá ke zlepšení obrazového kontrastu. Mnohdy však je to jev spíše rušivý, jako např. při pozorování tkáňových struktur na kultivačních miskách z lisovaných organických skel, což jsou materiály silně dvojlomné. V takových případech je vhodnější použít Hoffmanovu techniku.

Polarizační mikroskopie umožňuje zviditelnit struktury, jejichž stavební materiál se vyznačuje dvojlomem. Polarizační mikroskop se od běžného mikroskopu liší vloženým párem zkřížených polarizátorů a kompenzační destičkou. Dvojlomné objekty i jejich pozadí zobrazuje v pestrých barvách, přičemž konečný výsledek závisí jak na tloušťce a optických vlastnostech objektů, tak i na nastavení kompenzační destičky. Největší uplatnění nalezl polarizační mikroskop v krystalografii. ¨