Ubiquitin

Bílkoviny jsou základními stavebními kameny všech organizmů a zároveň drží ve svých rukou téměř veškerou výkonnou moc v buňce. V každém okamžiku svého života má buňka charakteristickou skladbu bílkovin. Zatímco mnohé bílkoviny vznikají po celou dobu života buňky, jiné jsou tvořeny pouze za stresových situací a pro určité děje je zase nezbytné periodické objevování a mizení určitých bílkovin. Exprese genů kódujících bílkoviny je složitě řízena na úrovni DNA a aktivita i funkce již hotových bílkovin může být ovlivněna posttranslačními úpravami. Nicméně jemná regulace na úrovni exprese genů nebo posttranslačních modifikací by byla zcela zbytečná, kdyby se bílkoviny v buňce neustále hromadily. Kromě toho se bílkoviny časem “opotřebují″ nebo dojde k jejich poškození a začnou být buňce spíše na škodu než k užitku. Je tedy zřejmé, že se žádná buňka nemůže obejít bez aparátu, který nepotřebné nebo poškozené bílkoviny ničí.

Bílkoviny mohou být likvidovány nespecificky v organelách k tomu určených – lysozomech. Vedle této v podstatě nahodilé degradace probíhá v buňce i proces specifický, jehož základem je připojení malé bílkoviny ubiquitinu k bílkovině určené pro další zpracování. Ubiquitin může být na bílkovinu připojen dvěma způsoby. V prvním případě jsou bílkoviny označeny jedinou molekulou ubiquitinu, která zde má pravděpodobně funkci regulační. Při druhém typu je cílová bílkovina značena několika ubiquitinovými molekulami, které tvoří vazbu jednak se značenou bílkovinou a jednak samy mezi sebou. Tento komplex čeká neradostný osud, neboť s největší pravděpodobností skončí v proteazomu, supramolekulárním útvaru, který molekuly ocejchované ubiquitinem likviduje.

Ubiquitin sám je docela zajímavý. Tato malá globulární bílkovina je v rámci eukaryotických organizmů (u prokaryot se nevyskytuje) pozorouhodně konzervativní – například ubiquitin kvasinky Saccharomyces cerevisiae se liší od ubiquitinu člověka pouze ve třech aminokyselinách. Gen pro ubiquitin se téměř nikde nevyskytuje samostatně – s výjimkou velmi primitivního střevního parazitického prvoka Giardia lamblia, který vlastní jediný samostatný gen, je ubiquitinový gen vždy spojen s nějakým dalším genem a ubiquitin je z bílkovinného produktu získán posttranslačním rozstříháním, navíc se nikdy nevyskytuje pouze v jedné kopii. Například u již zmiňované kvasinky S. cerevisiae je ve třech případech (geny UBI1,2,3) spojen s genem kódujícím ribozomální bílkovinu, což (jak se domníváme) jasně ukazuje logiku fungování buňky – čím více bílkovin se vytvoří (na ribozomech jsou totiž syntetizovány), tím více jich bude muset být i zničeno. Čtvrtým genem kódujícím ubiquitin je u S. cerevisiae polyubiquitinový gen, jehož translací vznikne polyprotein složený z pěti molekul ubiquitinu. Zatímco exprese genů UBI1,2,3 je neustálá, polyubiquitinový gen je exprimován pouze za stresových podmínek. I zde se nám může taktika buňky zdát velmi logická – za stresových podmínek, např. za zvýšené teploty, vzniká v buňce více chybných a nefunkčních bílkovin, které bude potřeba buď opravit, anebo ještě spíše zničit.

Procesu ubiquitinace se účastní celá řada bílkovin. Ubiquitin musí být nejdříve uvolněn ze složeného proteinu, který vznikl translací. To zajišťují produkty rodiny UBP genů (ubiquitin processing). Aby byl ubiquitin vůbec schopen vázat se na cílovou bílkovinu, musí být aktivován bílkovinou Uba1. Aktivace samozřejmě není zadarmo – na ubiquitinu vzniká makrooergická vazba (tj. vazby, při jejichž hydrolýze se uvolňuje větší množství energie [nad 25 kJ.mol^–1]) a buňku to stojí jednu molekulu ATP. Odstranění genu pro Uba1 je pro buňku letální, takže se zdá, že každá buňka je na ubiquitinaci zcela závislá. Vlastní spojení ubiquitinu a cílové bílkoviny zabezpečují produkty rodiny genů UBC, tzv. ubiqiutin-konjugační enzymy. Produkty UBC-genů byly většinou již dříve identifikovány v souvislosti s jinými buněčnými procesy. Např. S. cerevisiae má nejméně 11 různých Ubc-enzymů, mezi něž patří i produkt RAD6-genu (Ubc2), který byl již dříve odhalen v souvislosti s opravami a metabolizmem DNA, nebo Ubc3, který byl jako protein Cdc34 určen při studiu buněčného cyklu. To poukazuje na široké uplatnění ubiquitinačních procesů v životě buňky.

Někdy je nezbytné, aby při procesu spojení ubiquitinu s označovanou bílkovinou vypomohl i další účastník, protein kódovaný geny z rodiny UBR (ubiquitin-recognition). Tyto tzv. rekognázy tvoří komplex s cílovou bílkovinou a ten je pak rozeznáván enzymy Ubc-skupiny, které zajistí připojení ubiquitinu. Rekognázy nevybírají bílkoviny určené k ubiquitinaci a eventuálně i k degradaci náhodně, ale na základě určitých pravidel a signálů, které určují délku existence bílkoviny. Některé signály, které rekognázy dovedou číst, jsou krátké sekvence aminokyselin, jež se na povrch bílkoviny dostanou teprve sbalením molekuly do správného funkčního tvaru. Kromě toho se ale životnost bílkovin určuje i podle tzv. pravidla N-konce. O poločasu života bílkoviny v buňce totiž do značné míry rozhoduje první aminokyselina na N-konci (konec aminokyselinového řetězce se skupinou NH²). Je-li na tomto místě metionin (který zde vlastně má být – počáteční kodon genu vždy kóduje metionin), je poločas života bílkoviny delší než 15 minut. Pokud je ale metionin odštěpen, bílkoviny, kterým zbude zásaditá aminokyselina na N-konci (arginin, lysin, histidin), si užijí v buňce pouhé 3 minuty, zatímco leucin (popřípadě tryptofan, tyrosin a fenylalanin) dává bílkovinám naději na plných 5 minut aktivní činnosti (všechny příklady jsou ze života S. cerevisiae). Ovšem pravidlo N-konce, stejně jako mnohá jiná pravidla, neplatí všeobecně – v buňce mu podléhá jen asi 15 % bílkovin.

Ubiquitin se na cílový protein váže vždy izopeptidickou vazbou, která se vytváří mezi lysinem značené bílkoviny a aktivovaným C-koncem (druhý konec aminokyselinového řetězce se skupinou COOH) ubiquitinu. Protože i každý ubiquitin obsahuje lysin, může dojít, a často i dochází, ke vzájemnému propojení ubiquitinů za vzniku multiubiquitinové značky. Toto označení odsuzuje protein definitivně k degradaci v proteazomu.

Proteazom je supramolekulární útvar, který se vyskytuje v jádře i v cytoplazmě eukaryotické buňky a specificky degraduje značené bílkoviny na malé oligopeptidy za spotřeby ATP. Samotný ubiquitin je v poslední fázi degradace uvolněn bílkovinou Ubp4 a může se znovu zapojit do celého cyklu.

Objevení ubiquitinu není úplně nejnovější událostí. O jeho existenci se ví (alespoň na poměry panující v molekulární biologii) poměrně dlouho. Intenzivní výzkum bílkovinové degradace zprostředkované ubiquitinem se ve velkém rozproudil v druhé polovině 80. let. Ukazuje se, že se ubiquitin účastní mnoha procesů. Bílkoviny, jejichž aktivní činnost v buňce má být jen krátkodobá, jsou odstraňovány téměř výhradně v proteazomu po ubiquitinaci. Typickým zástupcem takovýchto proteinů jsou tzv. cykliny – jejich pravidelné mizení a znovuobjevování umožňuje buňkám správně načasovat jednotlivé děje nezbytné pro dělení buňky. Kromě toho se ubiquitinace podílí i na degradaci bílkovin určených k prezentaci antigenů (každá buňka vystavuje na svém povrchu fragmenty některých bílkovin přítomných uvnitř). V posledních letech bylo prokázáno, že množství ubiquitinovaných molekul prudce vzrůstá v buňkách rakovinné tkáně nebo při neurodegenerativních chorobách. Například Alzheimerovu nemoc je možné spolehlivě určovat na základě zvýšeného množství ubiquitinových komplexů v mozkomíšním moku. Zcela nové je zjištění, že může docházet k ubiquitinaci receptorů bezprostředně po jejich aktivaci (např. u TCR – povrchového receptoru T-buněk), takže se zřejmě ubiquitinový systém uplatňuje i při recyklaci nebo regulaci receptorů. A například rozbujelost ubiquitinového systému u rostlin je zárukou ještě mnoha disertačních prací v tomto oboru.

Maličký protein ubiquitin tedy slouží v buňce jako značka, jako bílý pruh na stromech určených k pokácení. To nejpodivnější – totiž složitost a košatost celého procesu ubiquitinace – nás upozorňuje na to, jak mimořádně důležité zřejmě pro buňku je rozlišování mezi dobrým a špatným, mezi potřebným a zbytečným.