G-proteiny a přenos buněčných signálů

Četné metabolické pochody a regulační procesy jsou v buňkách řízeny podle informací, které se do buňky dostávají z vnějšího, mimobuněčného prostoru od jiných více či méně vzdálených buněk. Tyto informace jsou většinou k buňkám přinášeny biologicky aktivními látkami, jako jsou hormony, neuromediátory, růstové faktory a podobné látky, které nemají schopnost dostat se do buněčného prostoru přímo přes membránu buňky, neboť ta je pro ně nepřekonatelnou překážkou.

Pro to, aby buňky mohly přijímat pokyny z vnějšího prostředí, aniž by látky, které tyto informace přinášejí, do nich přímo vstupovaly, jsou všechny buňky vybaveny speciálním aparátem. Jeho prvním článkem jsou receptory, bílkovinné útvary na povrchu buňky, jejichž specifická interakce s biologicky aktivní látkou je nezbytným krokem v procesu předávání buněčných informací z vnějšího prostředí do nitra buňky.

Receptory jsou stavbou své molekuly uzpůsobeny tomu, aby zprostředkovávaly spojení mezi vnějším (extracelulárním) a vnitřním (intracelulárním) buněčným prostorem, neboť jedna část jejich molekuly je umístěna na vnější straně buněčné membrány a druhá část na vnitřní straně membrány a zasahuje tedy do vnitřního prostoru buňky. Jsou to vysoce specifické bílkoviny, které interagují pouze s látkami, pro něž mají určité rozpoznávací znamení.

Jestliže dojde k tomu, že se setká biologicky aktivní látka, která přináší informaci, a její specifický receptor na povrchu buňky, receptor se aktivuje a nastartovává proces, který se nazývá přenos buněčných signálů. Je to kaskáda molekulárních dějů, jež následně zesilují přijatý informační signál a šíří jej dále buňkou až k cílovým proteinům, jimž je příslušná informace určena. Cílovým proteinem bývá většinou klíčový enzym určitého metabolického pochodu nebo regulační protein kontrolující například syntézu proteinu nebo expresi specifického genu.

Pro šíření informačních signálů má buňka k dispozici více mechanizmů. Informace dodaná buňce inzulinem se přenáší jiným způsobem než ta, kterou buňce předá hormon adrenalin. Také druh buňky je důležitý pro její vybavení mechanizmy potřebnými pro šíření informací. Jiné možnosti poskytují buňky krevního systému a jiné buňky svalové nebo nervové. U některých hlavních mechanizmů, které se uplatňují v přenosu buněčných informací, dochází následkem aktivace specifických membránových receptorů k aktivaci efektorových proteinů, které ve svém aktivovaném stavu rychle tvoří značné množství nízkomolekulární látky, tzv. “druhého posla (=messengera)″. Úlohou této látky je zesílení přijatého informačního signálu a jeho rozšíření dále do nitra buňky. Většinou tak, že aktivuje specifický enzym proteinkinázu, která katalyzuje kovalentní připojení fosfátu k molekule svých substrátů, fosforylaci.

Jakmile tedy dojde k interakci mezi druhým poslem a jeho specifickým cílovým proteinem (proteinkinázou), protein je aktivován, dodanou informaci přijímá a následně uskutečňuje tím, že fosforylací reverzibilně modifikuje jiný, pro něj specifický substrátový protein. Modifikací se potom mění vlastnosti tohoto proteinu, například jeho aktivita, lokalizace v buňce, konformace jeho molekuly a v důsledku toho i jeho úloha v buněčném pochodu, jehož se účastní.

Tento systém šíření informačních signálů buňkou prostřednictvím druhých poslů používají mimo jiné některé hormony, jako adrenalin, noradrenalin, folikuly stimulující hormon, adrenokortikotropní hormon (ACTH) nebo glukagon. Aktivace jejich příslušných receptorů má za následek tvorbu cyklického adenosinmonofosfátu (cAMP), druhého posla, který je tvořen aktivovaným efektorovým proteinem adenylátcyklázou. Objasnění mechanizmu regulace tohoto efektoru bylo r. 1994 oceněno udělením Nobelovy ceny za medicínu a fyziologii Martinu Rodbellovi a Alfredu G. Gilmanovi. Ti zjistili, že na kontrole aktivity adenylátcyklázy se uplatňují proteiny, které interagují s guaninovými nukleotidy a podle této vlastnosti byly nazvány G-proteiny. Tyto proteiny se nacházejí na vnitřní straně buněčné membrány, vázány na receptory, které zprostředkovávají jejich aktivaci. Jsou velmi důležitým spojovacím článkem mezi receptory na buněčném povrchu a intracelulárními efektorovými proteiny. Představují jakýsi molekulární vypínač, neboť mohou měnit, ve smyslu kladném i záporném, svou schopnost interagovat a tvořit komplexy se specifickými makromolekulami.

Centrální úlohu v tomto mechanizmu hraje malá molekula guanosintrifosfátu (GTP), která obsahuje, kromě báze guaninu a cukerné složky, také tři fosfátové skupiny. Odštěpením koncové fosfátové skupiny se uvolňuje energie a mění se konformace proteinu, na který je molekula GTP vázána. G-proteiny cyklují mezi aktivním a inaktivním stavem právě díky molekule GTP. Vazbou s GTP se G-proteiny aktivují, což je doprovázeno také tím, že G-protein začne navázané GTP hydrolyzovat, tj. odštěpovat koncovou fosfátovou skupinu z jeho molekuly. Tím se guanosintrifosfát mění na guanosindifosfát (GDP), který má na navázaný protein inhibující účinek, způsobený změnou konformace molekuly proteinu, kterou vyvolává přeměna GTP v GDP. Mechanizmus zapnutí: vazba GTP a vypnutí: hydrolýza GTP a jeho přeměna v GDP, je velmi pružný a dovoluje, aby byl příslušný G-protein aktivován jenom na dobu, než je veškeré GTP přeměněno v GDP. Ta je rozhodující pro rychlost celého procesu. Vazbou GTP tedy dochází pouze ke krátkodobé aktivaci membránově vázaných G-proteinů, které následně samy sebe postupně inaktivují. Doba aktivity G-proteinů, vyvolaná vytvořením jednoho komplexu hormonu s receptorem, je přibližně 10 sekund. Během této doby je přechodně aktivována také adenylátcykláza a tvořen cyklický AMP, který je aktivátorem vysoce specifické cAMP – dependentní proteinkinázy.

Molekula G-proteinů je složena ze tří podjednotek o různých velikostech. Podjednotka α je největší (relativní molekulová hmotnost asi 45 000) a charakterizuje celý G-protein. Obsahuje vazebné místo pro guaninové nukleotidy (GTP nebo GDP), má endogenní GTPázovou aktivitu a v důsledku toho schopnost navázané GTP hydrolyzovat na GDP a volný anorganický fosfát. Představuje tudíž samostatný enzym a je také vlastním regulátorem efektorových proteinů. Již přes 20 odlišných α-podjednotek G-proteinů (G_α) bylo zjištěno mezi bílkovinnými produkty kódovanými různými cDNA. Lze je rozdělit do 4 hlavních podskupin (G_s, G_i, G_q, G₁₂) na základě příbuznosti jejich aminokyselinových sekvencí a funkcí. Podle rekonstituce signální cesty pomocí jejích purifikovaných složek, kterou používá druhý posel cAMP, jsou proteiny podskupiny G_s stimulátory adenylátcyklázy a G_i jejími inhibitory.

Nedávno bylo zjištěno, že proteiny podskupiny G_q jsou zapojeny do aktivace fosfolipázy C (PLC), zprostředkované receptorem. Tento enzym katalyzuje tvorbu jiných druhých poslů, inositoltrifosfátu a diacylglycerolu, které se účastní další z cest přenášejících buněčné signály. Jsou aktivátory proteinkinázy C a také zřejmě ovlivňují hladinu vápenatých iontů v buňce.

Podjednotky α mnohých G-proteinů mají ve své molekule specifické úseky aminokyselin, které mohou být kovalentně modifikovány bakteriálními toxiny. Je to zejména ADP-ribosylace, kterou katalyzuje toxin cholery nebo černého kašle. Modifikace mohou způsobit inhibici GTPázové aktivity G-proteinu, a tím i jeho trvalou aktivitu, protože navázané GTP není hydrolyzováno, a nebo mohou zabránit aktivaci modifikovaného G-proteinu příslušným receptorem.

Trvalá aktivace α-podjednotky G-proteinu střevního epitelu, která kontroluje aktivitu adenylátcyklázy, je například klíčovou reakcí v patogenezi cholery. Způsobuje ji inkorporace ADP-ribózy, katalyzovaná toxinem cholery, která vyvolává inhibici GTPázové aktivity, a tak blokuje přeměnu GTP v GDP.

Podjednotky α některých G-proteinů jsou také modifikovány připojením mastných kyselin myristové nebo palmitové k N-konci jejich molekul, což přispívá k jejich vazbě k membráně a usnadnění interakce s komplexem βγ-podjednotek.

Podjednotky β a γ (G_β ,G_γ) jsou menší (relativní molekulové hmotnosti 37 000 a 8 000) a vyskytují se většinou společně v komplexu, který tvoří funkční jednotku. Váží se k inaktivní α-podjednotce, na kterou je navázáno GDP, zatímco se uvolňují od aktivní α-podjednotky vázající GTP. Komplex α-podjednotky s GDP stabilizují, neboť v jejich přítomnosti GDP disociuje 100krát pomaleji nežli disociuje od samotné α-podjednotky.

Vazebné místo na G_α pro nukleotidy je ve svém základním klidovém stavu obsazeno GDP. Aktivace zprostředkovaná receptorem, vyvolávající disociaci GDP a vazbu GTP, způsobuje tedy také oddělení α-podjednotky od dimeru podjednotek βγ. Za přichycení celé molekuly G-proteinu (heterotrimeru) k buněčné membráně odpovídá podjednotka γ. Obsahuje ve své molekule rozpoznávající motiv pro prenylaci, tj. navázání lipidů izoprenoidů, které umožňují interakci komplexu βγ s α-podjednotkami nebo s adenylátcyklázou.

Zatímco G_α obsahuje místo pro vazbu a hydrolýzu GTP, G_βγ zřejmě zprostředkovává komunikaci mezi jednotlivými signálními cestami. Dimery βγ v komplexech s α-podjednotkami G_s, G_i, G_q mohou být zaměňovány, a tak poskytují buňce možnost formovat stovky (možná i tisíce) odlišných molekul G-proteinů. Tyto proteiny vytvářejí v nitrobuněčném prostoru regulační síť, která je jimi kontrolována. Přesný význam a účel její existence není ještě zcela znám, ale pravděpodobně tkví v tom, aby byla co nejlépe zajištěna specificita přenosu informačního signálu, zejména při výběru receptoru a efektorového proteinu v různých typech buněk. Rozhodně přispívá také k integraci impulzů přicházejících z různých buněčných cest.

G-proteiny vázané na receptory se účastní, kromě tvorby některých druhých poslů, také procesu vidění a regulace funkce iontových kanálů. Jsou součástí velké rodiny tzv. “GTPáz″, neboli GTP-vázajících proteinů, které mají v buňce nejrůznější funkce.

Účastní se syntézy bílkovinné molekuly probíhající na ribozomech od bakteriálních až po savčí buňky, kontrolují buněčný růst, diferenciaci a proliferaci v živočišných buňkách, regulují translokaci proteinů a pohyb cytoplazmou. Také bílkovinný produkt p21^ras protoonkogenu, jehož mutovaná molekula vyvolává přeměnu normální buňky v buňku nádorovou, patří do rodiny proteinů vázajících GTP .

Každý z těchto proteinů používá pro svou aktivaci stejný mechanizmus. Váží GTP a hydrolyzují jej na GDP a fosfát. Hydrolýza GTP je irreverzibilní, a tak cyklus probíhá pouze jedním směrem. Uvolněním GDP se tyto proteiny dostávají do přechodné konformace vyvolané uprázdněním vazebného místa pro guaninové nukleotidy. Vazbou GTP se konformace proteinu mění v aktivní, vazbou GDP v konformaci inaktivní.

V molekulách všech proteinů vázajících GTP se nacházejí úseky, jejichž pořadí aminokyselin jsou buď shodná, nebo jsou si velmi podobná, což zřejmě souvisí se společným mechanizmem aktivace, který používají. Takto konzervovaná struktura a mechanizmus aktivace proteinů, které se vyskytují v bakteriích, kvasinkách i savčích buňkách, nasvědčuje tomu, že všechny tyto proteiny odvozují svůj původ od jediného proteinového prapředka. Jsou příkladem par excellence obdivuhodných evolučních možností přírody při vytváření širokého spektra rozmanitých funkcí z konzervované struktury a mechanizmu.

Zjištění, že se tyto proteiny účastní také přenosu signálních informací přes membránu buňky, je velmi významným příspěvkem k utváření celkového obrazu regulačních procesů probíhajících v buňce.