Věk genetiky: Začal dříve, než jsme čekali

Co všechno můžeme zjistit z genomu svých dětí ihned po narození a dokonce ještě před ním? A máme to chtít vědět?

Sci-fi film GATTACA z roku 1997 svým názvem odkazuje na písmena symbolizující báze genetického kódu. Velmi působivě sleduje osudy několika postav ve „věku genetiky“, kdy se čtení kompletní genetické informace stalo rutinou. Už v porodnici předpoví personál hlavnímu hrdinovi z kapky krve krátkozrakost, sklony k maniodepresivitě, násilnému chování a především velmi vysokou pravděpodobnost úmrtí na srdeční chorobu do věku 30 let. Ve světě, kde pouliční laboratoře poskytují na počkání analýzu všech genů kohokoli třeba jen z vytrženého vlasu, znamená takto „invalidní“ genetický profil hrdiny doživotní diskriminaci a odsouzení k podřadným pracím. Rodiče litují svého rozhodnutí ponechat početí syna na přírodě a u druhého dítěte již ve spolupráci s genetikem vyberou „nejdokonalejší“ z embryí pro umělé oplodnění. A teď realita: V roce 2012 publikovaly dva vědecké týmy postup, jenž potenciálně umožní čtení kompletní genetické informace plodu z krve matky již v těhotenství. Loni začalo několik pediatrických center v USA v rámci svého výzkumu číst genom u zdravých novorozenců po porodu. To, že „věk genetiky“ přijde tak rychle, nečekali snad ani samotní genetici.

Čtení genomu. Stále rychleji a levněji

Genetické metody, které s větší či menší přesností umožňují mapování celého genomu jedince, se využívají už od konce devadesátých let. První přečtení celého genomu člověka ještě původními metodami trvalo více než deset let a bylo dokončeno v roce 2001. V  roce 2005 přišel na trh první sekvenátor nové generace, který umožňoval současné sekvenování („čtení“) desetitisíců fragmentů DNA současně. Konkurenční boj firem dodávajících sekvenační přístroje a chemii v dalších několika letech srazil původně astronomické ceny řádově a zároveň zvýšil počet současně čtených úseků na miliardy. Výsledkem je, že v současnosti je již možné získat kompletní informaci o všech genech jedince během jednoho týdne a za cenu přibližně tisíc dolarů. Sekvenování nové generace nebo také masivně paralelní sekvenování přineslo během pouhých několika let doslova revoluci nejen v genetice, ale i ve většině oborů medicíny. V poslední době v literatuře převládl název next generation sequencing a jeho zkratka NGS se v současnosti již většinou nepřekládá (podobně jako třeba PCR, polymerázová řetězová reakce).

Terminologie není úplně přesná – nejrozšířenější formou NGS je v současnosti takzvané celoexomové sekvenování – z DNA se vyberou a sekvenují pouze oblasti genů kódujících proteiny, což znamená necelá dvě procenta genetické informace. Má to několik důvodů. V těchto úsecích se vyskytuje nejvíce změn s klinickými důsledky, zároveň jsou nejlépe zmapované a popsané, protože výsledné poškození na úrovni proteinu se dá dobře sledovat.

Obávaný BRCA1

Jedním z nejčastěji diskutovaných genů je gen BRCA1. Loni způsobila doslova mediální bouři zpráva, že herečka Angelina Jolie podstoupila dvojitou mastektomii jako prevenci nádoru prsu, protože je nositelkou mutace v tomto genu. Pokud je organismus vystaven škodlivým vlivům (přirozená radiace a další poškozující faktory), pak právě gen BRCA1 je klíčovým hráčem v procesu, který zajišťuje opravy zlomů v DNA jimi způsobených. Pokud v genu BRCA1 dojde k mutaci, tento komplex nemůže pracovat dostatečně efektivně a poškození v DNA se nahromadí, což velmi zvyšuje šanci na propuknutí nádorového bujení. Dosud není zcela jasné, proč se jedná právě o nádory prsů a vaječníků, ale zřejmě zde hraje roli ženský hormon estrogen. Současná doporučení pro nositelky nejzávažnějších z mutací se liší v různých zemích. Například v USA se ženám doporučuje podstoupit preventivně odstranění vaječníků do čtyřiceti let nebo ještě dříve po dokončení reprodukčního období. Po tomto zákroku poklesne hladina estrogenu a dojde k předčasné menopauze, zároveň se ale velmi sníží riziko rakoviny vaječníků i prsu. Angelina již oznámila, že odstranění vaječníků bude další operací, kterou hodlá podstoupit. Její případ spustil obrovskou vlnu zájmu o znalost vlastního genomu ­ a svět celebrit, ale i komunita genetiků se začíná dělit na ty, kteří svou genetickou informaci chtějí znát a kteří raději ne.

 Znát svůj osud

Typickým zastáncem první skupiny je průkopník v poli sekvenování lidského genomu, excentrický miliardář Craig Venter, který svou vlastní genetickou informaci dal volně k dispozici do webové databáze. Dalším takovým vědcem je Michael Snyder ze Stanfordské univerzity, který spolu se svým týmem uveřejnil svou kompletní genetickou informaci, navíc propojenou s obrazem přepisované RNA a proteinů. Sám také tvrdí, že tento profil (občas některými vědci ironicky nazývaný „narcisom“) mu umožnil včas rozpoznat riziko cukrovky, která u něj později doopravdy propukla po virové infekci. I sám objevitel DNA, James D. Watson, poskytl dobrovolně svou DNA k sekvenování. Vyhradil si ale, které informace chce znát a které ne. Při prezentování výsledků takzvaného „projektu Jim“ světu otevřeně oznámil, že nese mutaci v genu BRCA1 (a suše to komentoval slovy, že doteď nevěděl, jak je dobře, že nemá dceru…).Nechtěl ale znát varianty spojené s vyšším rizikem Alzheimerovy choroby s tím, že momentálně stejně neexistuje žádná její prevence.

Které údaje je tedy užitečné (dokonce někdy i život zachraňující) se dozvědět a které nikoli? To je předmětem debaty vedené v současnosti nejen ve vědecké komunitě, ale i v etických komisích. U dětí jsou jasným pozitivním případem vrozené vady metabolismu, především ty, u kterých může rychlý léčebný zásah umožnit naprosto plnohodnotný život, zatímco pozdní diagnóza vede k nenapravitelným škodám. Příkladem je vrozená nedostatečnost štítné žlázy, již lze poměrně jednoduše řešit včasným podáním hormonu tyroxinu, nebo fenylketonurie, kterou lze zvládnout speciálně upravenou stravou. Tyto nemoci ale lze diagnostikovat i jednoduššími metodami než je sekvenování DNA a už dlouhou dobu jsou součástí takzvaného novorozeneckého screeningu, prováděný u každého narozeného dítěte ze suché kapky krve odebrané z patičky. V současnosti v ČR běží screening třinácti onemocnění (jejich seznam je k dispozici na stránkách www.novorozeneckyscreening.cz). Nedávno přibyla k vyšetřovaným chorobám cystická fibróza (vrozená porucha tvorby hlenu) a diskutuje se o zavedení screeningu těžkého kombinovaného imunodeficitu (tzv. syndromu bublinových dětí).

Americká studie zmíněná v úvodu chce zkoumat, zda a jaký benefit bude mít znalost genomu dítěte hned po narození nejen pro ošetřující lékaře, ale i pro rodiče. Předpokládá se, že jasným plusem bude možnost objevení některých popsaných, ale velmi vzácných chorob, které nejsou zahrnuty v rutinním screeningu.

Záchrana v poslední chvíli

Sedmiletý Nic Volker z USA je nejznámějším dítětem, kterému již celogenomová sekvenace stačila zachránit život. Od svých dvou let přestal snášet jídlo, což vedlo k opakovanému proděravění střeva s nutností odstranění jeho části a zavedení umělého vývodu. Prodělal strastiplnou a pro rodinu finančně zničující „diagnostickou odyseu“ po nejrůznějších vyšetřeních, která nevedla k cíli. Teprve sekvenování exomu objevilo vzácnou mutaci v genu XIAP, jehož defekty se obvykle projevují trochu jiným klinickým obrazem a lze je řešit transplantací kostní dřeně. Tu chlapec podstoupil a dnes vede normální, spokojený život. Když lékaři objeví podobné mutace včas, zachrání tím mnoho dalších dětí, ale v důsledku také ušetří nemalé prostředky zdravotnímu systému. V současnosti je takovýchto vzácných onemocnění (jež se vyskytne u méně než jednoho člověka ze dvou tisíc a bývá převážně genetického původu, více na www.vzacnenemoci.cz) popsáno řádově stovky až tisíce a díky masivnímu rozvoji sekvenování neustále přibývají.

Tisíce odchylek – a co to znamená?

Sekvenování exomu ale odhalí navíc obrovské množství dalších odchylek od takzvaného referenčního genomu. To je databáze sekvencí DNA, která je konsorciem vědců uznána coby reprezentující lidský genom a která je neustále zpřesňována. I u zdravého člověka se vyskytují řádově desetitisíce změn. Co si ale počít s těmito informacemi? Většinu odchylek tvoří takzvané jednonukleotidové populační polymorfismy („single nucleotide polymorphisms, zkratka SNP). To jsou záměny jednotlivých bází, které mohou, nebo nemusí mít funkční důsledek a které jsou v populaci poměrně časté. Dříve se uznávala frekvence do jednoho procenta, v současnosti už mají přiděleno oficiální „registrační číslo“ i vzácnější odchylky. Četnost těchto změn v populaci se může velmi lišit. Například v genu pro kaspázu 12, podílejícím se na zánětlivé odpovědi organismu, má většina Evropanů zaměněn adenin za guanin, což vede k předčasné zástavě syntézy bílkoviny a tudíž k její nefunkčnosti. V africké populaci ale převažuje funkční varianta tohoto genu. Předpokládá se, že nefunkční kaspáza 12 představovala v hustě osídlené Evropě s velkým infekčním tlakem výhodu pro přežití, protože přinášela lepší odolnost k bakteriálním infekcím.

Skupinou genů, na jejíž důležitosti se vědecká komunita shoduje, jsou geny účastnící se zpracování léčiv v organismu. Jejich studiem se zabývá samostatný obor, farmakogenomika. Mutace nebo polymorfismy v těchto genech způsobují na jednu stranu zvýšené nežádoucí účinky při podání léků, zároveň ale mohou zlepšit výsledky léčby. Když zůstanu u svého oboru, kterým je dětská akutní lymfoblastická leukémie (ALL), mohu uvést jako příklad důsledky poškození genu TPMT (thiopurin metyltransferázy), který metabolizuje cytostatikum merkaptopurin. Nositelé těchto mutací lépe reagují na léčbu, ale mají také větší nežádoucí účinky včetně sekundárních malignit, to znamená nádorů způsobených samotnou léčbou. Pokud máme informaci o stavu genu TPMT, lze pacientům s nízkou aktivitou enzymu snížit dávku merkaptopurinu a předejít tak dlouhodobým nežádoucím ůčinkům. Je ale nutné zároveň sledovat, že leukémie i při snížené dávce dobře reaguje na léčbu, což se opět provádí metodami molekulární genetiky. Farmakogenomika by se měla stát jednou z  částí genetického testování, které budou nejrychleji zaváděny do praxe.

Co s těmi testy?

Je poměrně obtížné vytipovat mezi zjištěnými variantami (polymorfismy i mutacemi) ty, které mohou mít dopad na zdraví člověka. A je také velmi zrádné poskytovat zjednodušené informace na základě toho, že jedna nebo několik studií popsala danou variantu v souvislosti s nějakou chorobou. Už před nástupem NGS nabízely komerční firmy testování vybraných polymorfismů a mutací, ale interpretace výsledků pro laické zákazníky je doposud velmi sporná. Jen poměrně málo změn má tak jasný klinický dopad jako například mutace v genu BRCA. Výsledky typu „máte střední riziko cévní mozkové příhody, zvýšené riziko Alzheimerovy choroby, sportovní vlohy spíše pro vytrvalost než pro sprint, predispozici pro absolutní hudební sluch a možný sklon k závislostem“ vypadají zajímavě, ale pro jejich správnou interpretaci je důležité znát původní studie. Většina takovýchto informací pochází totiž z celogenomových asociačních studií (tzv. „GWAS“). Klasickou podobu takovéto studie uvedu opět na příkladu akutní lymfoblastické leukémie (ALL). První velká asociační studie publikovaná v časopise Nature Genetics v roce 2009 ukázala, že konkrétní polymorfismy ve třech genech (IKZF1, ARID5B a CEBPE) přinášejí vyšší riziko ALL. Výsledky studie ale ukazují, že například u nositelů polymorfismu v genu IKZF1 je riziko leukémie zvýšeno pouze 1,69krát.

Přestože je ALL nejčastějším nádorovým onemocněním u dětí, jeho výskyt v populaci je jen přibližně čtyři až pět případů na sto tisíc dětí. Proto i nositelé konkrétního („leukemického“) polymorfismu mají velmi malé riziko, že leukémii skutečně dostanou. A naopak, většina pacientů, kteří  leukémii dostanou, tento polymorfismus mít nebude. Co ale sdělí rodině komerční firma? A co si s tím počne rodina? Sám Craig Venter provedl už v roce 2009 porovnání výsledků dvou největších online firem testujících DNA, 23andme a Navigenetics. Výsledky shrnuté v časopise Nature ukázaly, že technická úroveň samotného čtení DNA byla u obou firem výborná, problém byl ale s interpretací výsledků. U sedmi chorob se předpověď obou firem shodovala pouze v polovině případů. I u dobře popsaných a častých mutací je velmi těžké zahrnout do předpovědi rizika všechny proměnné, jako je například rasa nebo věk pacienta.

Většina běžných chorob je ale způsobena souhrou mnohem více faktorů, které vzájemně spolupracují. Změny jsou často přítomny ve více genech, mutace v dalších mohou průběh nemoci zhoršovat, ale i zlepšovat. A především, do předpovědí nelze zahrnout  vlivy prostředí, jako jsou prodělané infekce, výživa a životní styl. V loňském roce vzbudil velkou pozornost poměrně drsný dopis, který zaslal americký úřad pro lékovou bezpečnost FDA firmě 23andme. V tomto dopise FDA požaduje, aby firma přestala poskytovat podobné předpovědi, a také varuje před rizikem falešné pozitivity či negativity vyšetření, zvlášť v důležitých genech jako je BRCA1 nebo v genech způsobujících odlišnou odpověď na léky.

Sdělit, či nesdělit?

Pokud bude celogenomové vyšetření interpretovat zkušený genetik a soubor výsledků bude obsahovat například výše zmíněný „leukemický“ polymorfismus, lékař výsledek pacientovi pravděpodobně nesdělí. Pacient však má teoreticky právo znát kompletní výsledek vyšetření. Pokud bude na základě čísla polymorfismu provádět průzkum internetu „na vlastní pěst“, zatíží sebe a svou rodinu naprosto zbytečným stresem. Existuje mnoho studií zkoumajících vliv prostředí na propuknutí ALL. Například kolegové z naší skupiny (CLIP, Childhood Leukemia Investigation Prague) na konci devadesátých let zaznamenali zvýšení nárůstu leukémií u předškolních dětí, což může souviset se změněným životním stylem po revoluci. Zvýšená infekční zátěž v krátkém časovém úseku u dítěte, které se předtím příliš nesetkalo s infekcemi, znamená pravděpodobně mírně zvýšené riziko propuknutí leukémie. Tento faktor, ale i další faktory popisované v některých studiích jako rizikové, lze ale velmi těžko ovlivnit. I kdyby rodič vystresovaný „predispozicí“ k leukémii nutil nebohé dítě podstupovat častá vyšetření a leukémie by opravdu propukla, může být diagnostikována jen asi o měsíc dříve. Neexistují ale žádné důkazy o tom, že časnější odhalení ALL znamená pro pacienta větší šanci na vyléčení.

Steve Jobs a poprvé přečtený genom nádoru

Oborem, do kterého celogenomové sekvenování přineslo doslova revoluci, je nádorová genomika. Genetická informace nádoru je obvykle směsí původní sekvence pacienta a velkého množství nově získaných mutací nebo větších změn v DNA, jako je zmnožení chromozomů či to, že zcela chybějí chromozomy nebo jejich částí. Výsledkem této kombinace je pak nekontrolovatelné množení nádorových buněk.

Jay Flatley, šéf firmy Illumina (jednoho z hlavních výrobců přístrojů pro NGS) nedávno prohlásil, že rakovina by se během deseti let měla stát chronickým onemocněním.

Velké množství genetických změn bylo samozřejmě objeveno již pomocí klasických metod genetiky. NGS ale přineslo mnohem komplexnější a podrobnější pohled na to, jakým procesem nádorový klon vzniká, jak odpovídá na léčbu a co způsobí, že se začne chovat agresivně a začne metastazovat. Znalost všech mutací umožní aplikaci léků cílících přímo na poškozený protein nebo na metabolickou dráhu, ve které je zapojen.

Jedním z prvních pacientů, který podstoupil celogenomové sekvenování svého nádoru, byl Steve Jobs.

V roce 2009 sekvenoval tým vědců z několika pracovišť za tehdy astronomickou částku sto tisíc dolarů jeho nádor slinivky. Ani znalost kompletní genetické informace ale Jobse bohužel nezachránila. I když o jeho případu neexistuje vědecká publikace, lze spekulovat, proč se tak stalo. S největší pravděpodobností v té době neexistoval cílený lék na žádnou z nalezených změn.

Jak zabránit metastázám a jak to zaplatit

I když ale v nádorové DNA existuje cíl pro dostupnou biologickou léčbu (používají se pojmy „druggable“ nebo „actionable targets“), nemusí to znamenat automatickou výhru.

Genomické studie ukázaly, že většina nádorů je vlastně směsí menších klonů buněk, které mají většinou jednu nebo více společných aberací, ale liší se v dalších změnách. V průběhu léčby některé z těchto klonů zanikají, ale některé přežívají, dále mutují a zapříčiňují vznik metastáz nebo u leukémií návrat nemoci, takzvaný relaps. Aplikace klasické léčby, ale i moderních cílených léků může zasáhnout jen část nádorové populace, a proto se nádor později vrátí.

Nová cílená léčiva se nejrychleji uplatňují v praxi u jinak neléčitelných nádorů, jako je tomu například u pokročilého melanomu. Onkologická centra v České republice už u tohoto i dalších nádorů běžně testují hlavní mutace cílitelné inhibitory a při pozitivním nálezu indikují léčbu. Stále ale přibývají jak popsané mutace, tak jejich inhibitory, ty jsou ale většinou velmi drahé, takže je otázkou, jak v budoucnu zdravotní systém zvládne tuto finanční zátěž.

U nádorů dobře léčitelných současnou léčbou, jako je právě dětská ALL, je nasazení nových, nevyzkoušených léčiv eticky velmi sporné. Moderní léčebné protokoly používající kombinaci cytostatik vyléčí až devadesát procent dětí. Metody molekulární genetiky navíc umožňují velmi přesné rozdělení pacientů na ty, kteří mají malé riziko relapsu (a stačí jim tedy méně agresivní léčba) a na ty, kteří potřebují co nejintenzívnější léčbu, v nejtěžších případech následovanou transplantací kostní dřeně. Tím se daří omezit u části pacientů léčebnou zátěž a riziko dlouhodobých nežádoucích účinků. Moderní genomiku hledající cíle pro biologickou léčbu je tak vhodné aplikovat především u malé části pacientů, u kterých klasická léčba selže.

Sporný screening novorozenců

Sekvenování genomu u dětí má velká etická úskalí a ozývají se už i hlasy volající po jeho zákazu. Podle jednoho názoru by u zdravých novorozenců mohlo být řešením sekvenování panelu několika stovek klinicky nejdůležitějších genů ve formě rozšířeného novorozeneckého screeningu a celogenomové sekvenování by přišlo na řadu až v případě propuknutí vážné nemoci nebo nádoru. Jedním z problémů, které zbývá dořešit, je uchování anonymity dat a rozhodnutí, kdy a zda vůbec mají být smazána. V loňském roce vzbudil rozruch článek skupiny bioinformatiků v časopise Science.

Ti se pomocí chytrého propojení veřejně přístupných sekvenačních dat s genealogickými databázemi a registry osob pokusili odhadnout identitu anonymních „dárců“ vlastní genetické informace. Například v případě genů Craiga Ventera se jim to podařilo.

Kromě všech zmíněných je tu další velký problém: Nebudou rodiče nutit dítě k určité životní dráze, povolání nebo sportu na základě informace o jeho genetických vlohách? Situace se bude jistě zhoršovat s tím, jak budou přibývat informace o genech zodpovědných za intelektové schopnosti.

Což vzbuzuje otázku, zda má rodič vůbec právo znát kompletní genom svého dítěte. A co teprve, když se posuneme do ještě dřívějšího období, tedy prenatální nebo dokonce preimplantační diagnostiky. Preimplantační diagnostika, tedy genetické vyšetření embryí před zavedením do dělohy při asistované reprodukci se už v současnosti provádí, pokud u plodu hrozí vážné genetické poškození.

Lze jen těžko domyslet, co by přinesla znalost celého genomu plodu a případná možnost výběru mezi více zdravými embryi. Což je už vlastně situace, o které pojednává film GATTACA. Hrdina filmu si nakonec splní svůj sen a navzdory špatnému genetickému profilu (který se mu podaří utajit) odletí na misi do vesmíru. To dává naději (kterou já upřímně sdílím), že ne vše o duši člověka a jeho schopnosti jít za svými sny bude možno přečíst z  jeho genetického kódu.