Cesta optické mikroskopie k superrozlišení

První mikroskopy se začaly objevovat již v 17. století a koncem 19. století se prodávaly špičkové mikroskopy s dokonale korigovanou barevnou vadou (Vesmír 83, 146, 2004/3). Kompletní teorie zobrazení, kterou vypracoval Ernst Abbe (1840–1905, Vesmír 91, 531, 2012/9), obsahovala i zásadní rovnici rozlišovací schopnosti mikroskopie, která stanovila difrakční bariéru (viz rámeček) a je vytesána do kamene na památníku v Jeně. Hranice dosažitelného optického rozlišení, kdy dva body rozeznáme od sebe a nesplynou v bod jeden, vychází podle ní na 200–250 nm. Tento limit byl nepřekročitelný po celé 20. století.

Fluorescenční mikroskopie

Ve 20. letech minulého století uvedla na trh firma Reichert Wien první fluorescenční mikroskop. Pracoval na principu excitace fluorescenčních látek ve vzorku a díky jejich emisnímu světlu mohl mikroskop rozlišovat autofluorescenční detaily od ostatních. Vzápětí se začaly používat fluorescenční látky, které dokázaly selektivně označit jen určitou část vzorku, a tím ji zvýraznit v zorném poli mikroskopu. Např. barvivo s názvem DAPI (4‘,6-diamidin-2-fenilindol) obarví pouze jádro buňky a při excitaci UV světlem vidíme krásně modře zbarvené jádro v emisním světle a lze rozlišovat, které detaily jsou uvnitř jádra a které vně. Díky možnosti selektivně barvit jednotlivé buněčné organely získala fluorescenční mikroskopie obrovskou popularitu a na jejím základě je založena diagnostika mnoha nemocí.

Další objev v oblasti mikroskopie, a to pozorování ve fázovém kontrastu, kdy jsme schopni pozorovat i nekontrastní preparát bez jakéhokoli barvení, byl oceněn Nobelovou cenou v roce 1953 pro Fritse Zernikeho (1888–1966).

Od elektronové k fluorescenční mikroskopii

Analýzou nedotknutelné difrakční rovnice zjistíme, že mnoho možností prolomení této bariéry nemáme. Index lomu (n) prostředí mezi vzorkem a objektivem u vzduchu činí 1, na vyšší hodnoty než 1,5 se nedostaneme bez toxických imerzních olejů. Sin α určitě nemůže být větší než 1 (1 se může rovnat pouze v ideálním případě, když počítáme s nulovou pracovní vzdáleností a nekonečnou šířkou objektivu). Zbývá nám vlnová délka λ v čitateli, ovšem oblast viditelného světla končí někde u hodnoty 450 nm, UV záření je pro nás již neviditelné.

Nicméně vědci 20. století již měli k dispozici teorii kvantové mechaniky, která každé částici přiřazovala doprovodnou vlnu s velmi krátkou vlnovou délkou λ. Použití elektronů místo fotonů přivedlo do mikroskopie úplně nové odvětví zvané elektronová mikroskopie. Tyto mikroskopy dokážou rozlišit detaily až o dva až tři řády menší než nejlepší optické mikroskopy. Za objev elektronového mikroskopu obdržel v roce 1986 Nobelovu cenu za fyziku Ernst Ruska (1906–1988). Vědci získali možnost pozorovat nitrobuněčné detaily od mitochondrií a virů až po strukturu DNA. Tak jak mají elektrony velmi krátkou doprovodnou vlnu, tak problematičtější je to však s jejich schopností pohybovat se v reálném světě. Maximální tloušťka vzorku pro transmisní elektronový mikroskop (TEM) je pouze několik desítek nanometrů (1 nm je miliontina milimetru) a elektrony se musí pohybovat ve vakuu. To je však pro život velmi nepřátelské prostředí, proto všechny vzorky pro elektronové mikroskopy musí být již fixované a nelze pozorovat živé organismy. Proto se pozornost opět obrací k fluorescenční mikroskopii, a to zejména koncem 20. století, kdy byl izolován tzv. zelený fluorescenční protein (GFP). Vědci dostali nové možnosti značkování na úrovni genů „přilepením“ proteinu GFP a posléze i dalších barevných proteinů. Za objev GFP získali v roce 2008 Nobelovu cena za chemii Osamu Shimomura, Martin Chalfie a Roger Y. Tsien.

Od fluorescenční ke konfokální mikroskopii

Fluorescenční mikroskopie trpí kromě difrakční bariéry ještě jedním neduhem: excitací celého objemu vzorku totiž dostáváme u fluorescenčního mikroskopu nejen signály z vrstvy, která je zaostřena, ale i světlo z prostoru nad a pod rovinou ostrosti. To fluorescenční obrázek charakteristicky zamlžuje. Tento nedostatek se vědci rozhodli vyřešit pomocí konfokálních laserových skenovacích mikroskopů.

Tyto mikroskopy dokážou pomocí dvou konfokálně umístěných irisových clonek (pinhole) mechanicky odclonit neostrou informaci vznikající nad a pod rovinou ostrosti a získat tenounký optický řez vzorkem. Pokud těchto rovin sejmeme v ose z několik, můžeme rekonstruovat kompletně zaostřený fluorescenční obrázek (např. buňky) obdobně, jako skládáme jednotlivé řezy lidského těla na počítačovém tomografu.

Princip konfokální mikroskopie patentoval Marvin Minsky r. 1957, avšak jeho vynález se uplatnil až o třicet let později. Na uvedení konfokální mikroskopie do praxe se podstatně podíleli také Mojmír Petráň a Milan Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni, kteří r. 1965 sestavili konfokální mikroskop s tzv. rotujícím diskem.¹⁾

Superrozlišení

Na konci 20. století jsme tedy schopni pozorovat živé organismy v ostrých konfokálních fluorescenčních obrázcích – ovšem s uctivým respektem k nedotknutelné difrakční hranici 200 nm. Již však v letech 1992 a 1994 se v literatuře objevují články prof. Stefana Hella seznamující s principy mikroskopů 4PI a STED, které elegantními triky obcházejí více než 100 let neotřesitelnou difrakční bariéru (Vesmír 87, 430, 2008/7). Spolu s vývojáři a konstruktéry firmy Leica Microsystems byl r. 2004 vyvinut a na trh uveden první superrozlišovací mikroskop Leica TCS 4PI a v r. 2007 systém Leica TCS STED. Zejména systém STED (STtimulated Emision Depletion – stimulované potlačení emise) se v praxi osvědčil jako jediný čistě hardwarový a optický superrezoluční mikroskop, který v současnosti dosahuje rozlišení pod 50 nm v osách xy a 150 nm v ose z, a to včetně pozorování živých buněk, a dokonce i velmi rychlých procesů v nich.

Jak fungují tyto elegantní triky? STED je konfokální metoda a používá zobrazování bod po bodu skenováním vzorku laserovým paprskem. Ani tento bod ale nejsme schopni kvůli difrakčnímu limitu zaostřit na menší hodnotu než asi 200 nm. Pro zmenšení tohoto skenujícího bodu se používá depleční laser, který obklopuje dokola ve tvaru koláče (donut) excitační laserový paprsek a potlačuje emisi fluorescence okolo tohoto paprsku. Fluorescence je tedy vybuzena jenom uprostřed koláče, průměr skenovacího paprsku se dostává na hodnoty nižší než 50 nm, a tím se zvyšuje rozlišovací schopnost mikroskopu.

Metoda GSDIM (Groud State Depletion followed by Individual Molecule return) naopak využívá jevu, kdy výrazným zvýšením energie excitačního zdroje fluorescence se elektrony místo prakticky okamžitého návratu zpět do základního energetického stavu v jednotkách nanosekund a vyzáření fluorescence dostávají nejprve na energetické stavy zvané tmavé hladiny (dark stages). Teprve z nich se náhodně vracejí do základní energetické hladiny v časovém řádu stovek milisekund a vyzáří fluorescenční fotony. Ve skutečnosti pozorujeme záblesky těchto fotonů a jsme schopni lokalizovat jejich pozici. Z fyzikálního hlediska víme, že každý záblesk vyzařuje jednotlivá molekula o velikosti jednotek nanometrů. I když se tyto záblesky podle difrakční teorie zobrazují do bodu o velikosti minimálně 200 nm, my jsme schopni tyto signály po matematické operaci do výsledného mikroskopického obrázku zobrazit na daném místě ve správné velikosti několika nanometrů. Tím postupně získáme obrázek v superrozlišení u standardního mikroskopu. U obou metod místo snahy o překročení nekonečna či fyzikálních hranic jde o jejich elegantní obejití.

Jakkoli jsme z elektronové mikroskopie znali tvar „poddifrakčních“ mikroskopických organel či virů a proteinů, nyní je máme možnost pozorovat živé v jejich přirozeném vodním prostředí a v reálném čase. V roce 2014 ocenil Nobelův výbor tyto objevy cenou za chemii za superrezoluční konfokální mikroskop STED Stefana Hella. Eric Betzig a William Moerner získali ocenění za klasický widefieldový superrezoluční mikroskop GSDIM.

Pokud bychom se dokázali vžít do kůže nejrůznějších virů, ať již jde o chřipku, HIV či ebolu, a doslechli se o pokroku na mikroskopickém poli, pak by nám jistě naskočila husí kůže. Pokrok poznání v oblasti optické mikroskopie doznal počátkem 21. století díky superrozlišení, supercitlivosti, libovolné volbě excitační vlnové délky a možnosti pozorování v reálném čase úžasného zrychlení.