Proměny světelné mikroskopie ve 20. století

Rozlišovací schopnost mikroskopů, kontrast a jas

Bez ohledu na technologický pokrok, který přineslo uplynulé století, naráží zkoumání mikroskopických objektů metodami světelné mikroskopie na omezení plynoucí z konečné rozlišovací schopnosti mikroskopů. ²⁾ Při použití krátkovlnného modrého světla (λ ≈ 400 nm) a nejkvalitnějších objektivů se teoretická mez rozlišovací schopnosti v rovině obrazu (laterální rozlišovací schopnost) rovná zhruba 200 nm; ve směru optické osy objektivu (axiální rozlišovací schopnost) činí přibližně 500 nm. Je tedy zřejmé, že není v moci světelných mikroskopů pozorovat například makromolekulární komplexy ³⁾ uvnitř živých buněk.

Při úvahách o teoretické mezi rozlišovací schopnosti objektivu (a tím i celého mikroskopu) si musíme uvědomit, že jí lze v praxi dosáhnout, jen pokud jsou jednotlivé detaily zobrazeny dostatečně kontrastně vůči pozadí (Vesmír 74, 638, 1995/11). Není-li tomu tak, jemné detaily neuvidíme, ani když jejich rozměry očekávanou rozlišovací schopnost výrazně překročí. Jestliže tyto detaily pozorujeme v procházejícím světle, což je nejstarší a zároveň i jedna z nejpoužívanějších metod světelné mikroskopie, je kontrast nepatrný, neboť objekty menší než 1 mikrometr neovlivní intenzitu procházejícího světla dost výrazně. Více než sto let se k pozorování velmi malých objektů používá metoda temného pole, při níž se osvětluje tak, aby světlo ze zdroje nevstupovalo přímo do objektivu. Můžeme vidět i objekty menší, než je teoretická rozlišovací schopnost mikroskopu, proto se tato metoda někdy nazývá ultramikroskopie. ⁴⁾ Naneštěstí se temné pole pro výzkum složitých objektů (např. živých buněk) nehodí, neboť nepříjemně zvýrazňuje jemné detaily. Jestliže se však lidský zrak nahradí snímací kamerou a počítačovým zpracováním obrazu, můžeme submikroskopické objekty (menší než je teoretická rozlišovací schopnost mikroskopu) pozorovat některými postupy, které se v biologickém výzkumu běžně používají (jedním z nich je např. diferenciální interferenční kontrast). Zdánlivá velikost zobrazených submikroskopických objektů přitom sice zůstává zhruba rovna konkrétní rozlišovací schopnosti mikroskopu, jejich dráhu však můžeme zkoumat s přesností pouhých nanometrů. Jako příklad uveďme sledování kroků kinezinového molekulového motoru (Vesmír 75, 309, 1996/6), kráčejícího podél mikrotubulu. ⁵⁾

V biologickém výzkumu má problém kontrastu zobrazení ještě jeden aspekt, který s rozlišovací schopností mikroskopu skoro nesouvisí. Samotné buňky a jejich vnitřní struktury jsou průhledné a až na výjimky (pigmentové buňky, erytrocyty, chloroplasty, spory plísní) bezbarvé. Při běžném pozorování v procházejícím světle je nevidíme s dostatečným kontrastem, neboť téměř neabsorbují procházející světlo. Tradičně se tento problém řešil nejrůznějším specifickým barvením. Mnohé z barvicích postupů jsou založeny na chemických reakcích barviv s látkami uvnitř buněčných struktur. Kromě zdroje kýženého kontrastu (vedle rozdílů v jasu se uplatní i barevný kontrast) některé metody barvení nabízejí také jednoduchou formu mikrochemické analýzy. Nevýhodou většiny barvicích postupů je jejich časová náročnost, navíc zpravidla nejde o metody, které by byly vhodné pro studium dynamických pochodů v živých buňkách, a nelze jimi proto poznávat, jak buňky skutečně fungují.

Třebaže buňky a jejich organely neabsorbují světlo, dávají o sobě vědět tím, že mění fázi procházejích světelných vln. Změna je úměrná součinu tloušťky objektu a indexu lomu, navíc se část dopadajícího světla v důsledku rozptylu nebo lomu vychýlí z původního směru šíření. Žádný detektor světla, ani lidské oko, nereaguje na fázi detekovaných světelných vln. Tu můžeme zkoumat pouze pomocí důmyslně využitých interferenčních jevů. V roce 1953 byla udělena Nobelova cena holandskému fyzikovi Fritsi Zernikovi za objev fázového kontrastu. Oceněná metoda rafinovaným způsobem využívá interferenci mezi difraktovanou ⁶⁾ a nedifraktovanou složkou světelného záření, které prošlo zkoumaným objektem. Tato interference převádí fázové rozdíly mezi světelnými vlnami, které prošly různě tlustými místy vzorku, na viditelné rozdíly v jasu odpovídajících míst jeho mikroskopického obrazu (viz doprovodné snímky). Zernikův fázový kontrast lze považovat za jeden z revolučních kroků ve vývoji moderní biologie, neboť umožnil přírodovědcům studovat buněčné nitro, aniž musí zkoumané buňky zabíjet fixací či barvením. Ani metoda fázového kontrastu však není prosta specifických experimentálních problémů. Vzniká halo (jasně zářící prstence) kolem výrazně konvexních objektů (v idealizovaném případě sférických) o vysokém indexu lomu. Nedávno však byla představena modifikovaná verze fázového kontrastu s potlačeným halo, tzv. apodizovaný fázový kontrast.

Snaha vypořádat se s problémy, které fázový kontrast přinesl, podnítila vývoj dalších metod vizualizace fázových objektů. Nejúspěšnější a nejdokonalejší z nich se zatím zdají být Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) a Hoffmanův modulační kontrast (HMC), metody, které na rozdíl od fázového kontrastu nepřevádějí na jas obrazu optickou tloušťku vzorku, ale její gradienty v jednom směru, který je určen nastavením mikroskopické optiky. Zobrazení zaostřených rovin libovolného vzorku proto připomínají trojrozměrné, jakoby ze strany nasvícené objekty.

Fluorescenční mikroskopie a její varianty

Ačkoli fázový kontrast, Nomarského diferenciální interferenční kontrast i Hoffmanův modulační kontrast stále představují nepominutelnou součást arzenálu buněčné a molekulární biologie, jsou dnes již zastíněny fluorescenční mikroskopií (viz Vesmír 79, 438, 2000/8), která nabízí biologům dvě velké výhody:

• Vynikající kontrast zobrazení získaný díky tomu, že celá část vzorku, která neobsahuje fluorochromy, zůstává temná. S tím souvisí vysoká citlivost, jež se blíží schopnosti detekovat jednotlivé molekuly a je jinými metodami optické mikroskopie nepřekonatelná. K fluorescenčnímu barvení stačí nízké koncentrace barviv, které téměř neovlivňují buněčné funkce.
• Stovky fluorescenčních sond a značek (viz http: //www.probes.com) vyrábí několik velkých chemických firem. Řada buněk má své vlastní fluorochromy, které jsou schopny autofluorescence,jednoznačně však převažují experimenty s vnášenými fluorescenčními barvivy. Běžné jsou fluorescenčně značené protilátky sloužící k vizualizaci buněčného cytoskeletu, fluorescenční indikátory pH a koncentrace intracelulárních iontů, sondy k monitorování membránového potenciálu atd.

  Mimořádné postavení mezi fluorescenčními značkami si během posledního desetiletí vydobyl zelený fluorescenční protein (GFP – Green Fuorescent Protein), který byl nalezen ve světélkující medúze pohárovce Aequorea victoria (Vesmír 71, 581, 1992/10). Sekvenci DNA kódující tento intenzivně fluoreskující protein (popřípadě jeho modrozeleně a žlutě fluoreskující varianty nebo nepříbuzný červeně fluoreskující protein) lze pomocí rekombinantní DNA spojit s geny libovolných proteinů, o něž se zajímáme. Vložíme-li tyto konstrukty do živých buněk, nesou studované proteiny navíc sekvenci zeleného fluorescenčního proteinu – obsahují fluorescenční značku, která umožňuje identifikovat daný protein v konkrétních buňkách a studovat jeho nitrobuněčný výskyt. Pokud je tato sekvence připojena ke genu s přirozeným promotorem, pomůže rozpoznat, co příslušný gen produkuje. ⁷⁾ S rostoucí nabídkou fluorescenčních sond a značek přibyly experimenty, které využívají vícenásobné barvení (např. pro lokalizaci různých receptorů pomocí jejich ligandů značených rozdílnými fluorescenčními barvivy, a to v jednom experimentu). Vícenásobné barvení si vynutilo rozvoj mikrospektroskopických zobrazovacích metod, které umožňují stanovit podíly jednotlivých barviv v celkové emisi. Vedle jednoduchých analýz, jež porovnávají několik digitálních obrazů nasnímaných postupně s různými excitačními a emisními filtry, se také používají podstatně složitější metody hyperspektrálního zobrazování, které vycházejí z postupů vyvinutých pro dálkový průzkum Země.

  Ve fluorescenční mikroskopii se objevila řada velice specializovaných metod, ⁸⁾ jež umožňují získat věrohodnou informaci o fyzikálních vlastnostech bezprostředního okolí použité fluorescenční sondy. Polarizovaná fluorescenční mikroskopie difenylhexatrienu a dalších lipofilních sond zabudovaných do buněčných membrán slouží k sledování místních rozdílů v uspořádání membránových lipidů. Stanovení dob dohasínání fluorescence metodou FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) se uplatňuje všude tam, kde měříme intenzitu fluorescence jako odezvu na změny interakcí sondy s jejím okolím (bez rušivého vlivu lokálních rozdílů v koncentraci sondy).

  Stanovení dob dohasínání fluorescence má zásadní význam při sledování molekulárních interakcí a mezimolekulárních vzdáleností pomocí nezářivého přenosu excitační energie. Nezářivý přenos excitační energie (FRET – Fluorescence/Förster Resonance Energy Transfer) je důsledek interakce mezi elektrickými dipóly dvou fluorochromů – donoru, který absorbuje excitační záření, a akceptoru, který po nezářivém přenosu excitace emituje svoji vlastní fluorescenci, přičemž fluorescence donoru přestává být pozorovatelná. K tomu, aby vůbec k nezářivému přenosu došlo, musí emisní spektrum donoru částečně překrývat absorpční spektrum akceptoru. Výsledná účinnost nezářivého přenosu excitační energie je nepřímo úměrná šesté mocnině vzdálenosti mezi donorem a akceptorem. Prakticky využitelných hodnot v rozpětí procent až desítek procent kvantového výtěžku fluorescence donoru se dosahuje při mezimolekulárních vzdálenostech ležících v rozmezí 1–10 nm. Nezářivý přenos excitační energie proto představuje indikátor nepatrné vzdálenosti donor-akceptorových párů fluorochromů, jejichž umístění lze prokazovat při vzdálenostech až stokrát menších, než je reálná rozlišovací schopnost mikroskopu v běžném fluorescenčním modu. Proto je tato metoda nenahraditelným nástrojem biologů zkoumajících prostorové rozložení membránových receptorů nebo interakce mezi proteiny.

  V buněčných membránách a jejich těsné blízkosti se odehrávají klíčové procesy. Pro jejich studium mají mimořádný význam metody, které zviditelňují buněčné povrchy a vylučují rušivý vliv fluorescence z hlubších oblastí cytoplazmy. Zajímavý způsob řešení tohoto problému představuje fluorescenční mikroskopie využívající totální odraz excitačního záření na povrchu podložního sklíčka (TIRF – Total Internal Reflection Fluorescence). Fluorescenci zkoumaných vzorků budí v tomto případě „postupně mizející“ světelná vlna, která vystupuje ze skla do vzdálenosti okolo 100 nm, a my vidíme pouze membránové struktury přilehlé k podložnímu sklíčku a jejich nejbližší okolí.

Lasery, počítače a polovodiče

Odhlédneme-li od pokroku spojeného s rozvojem fluorescenčního sondování živých buněk a vynálezů několika nových metod pozorování fázových objektů (fázového kontrastu, DIC a HMC), určuje z velké části současnou podobu světelné mikroskopie technologický pokrok ve vývoji laserů, počítačů a polovodičových detektorů světla (CCD kamer).

Lasery, emitující monochromatické světlo v podobě dokonale rovnoběžných paprsků, jsou zdrojem světla, které v epifluorescenčním modu (při osvětlení vzorku skrz objektiv) může mikroskopický objektiv fokusovat do bodu o rozměrech srovnatelných s jeho rozlišovací schopností. Využívá se to například v laserové konfokální mikroskopii (Vesmír 74, 508, 1995/9), která umožňuje selektivní zobrazení roviny, do níž je mikroskop fokusován. ⁹⁾ Tuto fluorescenční tomografii mikroskopických objektů provází výrazné zlepšení kontrastu zobrazení, protože jsou potlačeny rozmazané obrazy nezaostřených rovin.

Jiná tomografická metoda využívá vysokou intenzitu fokusovaného laserového záření, při níž je vyvolána dvoufotonová fluorescence. Zjednodušeně řečeno, pro vybuzení excitovaného stavu jednoho fluorochromu se složí energie dvou fotonů. Protože pravděpodobnost dvoufotonových excitací roste kvadraticky s intenzitou budicího záření, je veškeré nežádoucí záření z nezaostřených rovin zanedbatelné – a na tom je tato fluorescenční tomografie založena. Ve srovnání s mnohem více rozšířenou konfokální mikroskopií má dvoufotonová fluorescenční tomografie tu výhodu, že dlouhovlnné excitační záření (λ > 800 nm) proniká při zkoumání tlustých vzorků do mnohem větší hloubky než při běžné jednofotonové excitaci. Dvoufotonová excitace navíc výrazně redukuje problémy spojené s „vysvícením“ (fotodegradací) fluoreskujících molekul, neboť mimo ohnisko, kde není intenzita laserového záření dostatečně vysoká, nebývají fluorochromy excitovány, a tím ani vysvíceny. Při základní laserové konfokální mikroskopii tomu tak není. Fluorochromy se mohou vysvítit i poměrně daleko od ohniskové roviny, a pak může poklesnout intenzita fluorescence v později snímaných optických řezech.

Fotodegradaci fluorochromů navázaných na membránové molekuly naopak cíleně využívá technika FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching), která slouží k měření difuzní kinetiky membránových komponent (lipidů a proteinů). Fotodegradace nastane při krátkém intenzivním pulzu laserového paprsku zaostřeného na povrch buňky. Následuje difuze nevysvícených molekul z okolí, která se projeví obnovenou fluorescencí v místě, do nějž byl intenzivní pulz zaměřen. Difuzní kinetika se stanoví podle časového průběhu nárůstu intenzity této fluorescence. K měření lokální koncentrace a difuzních koeficientů fluorescenčně značených makromolekulárních komplexů slouží také metoda FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy), jež je založena na analýze změn intenzity fluorescence vybuzené v pikolitrových objemech totožných s ohniskem laserového paprsku zaměřeného do zkoumaného vzorku.

Počítače přispěly k proměnám světelné mikroskopie ve třech směrech:

• Široce se uplatnily při fyzikálních simulacích průchodu světla optickými systémy mikroskopů, což spolu s rozšiřující se nabídkou nových typů skel pronikavě zlepšilo kvalitu moderních objektivů i daších optických dílů mikroskopů.
• Automatizovalo se ovládání mikroskopů (posuvy stolku, zaostřování ad.). Bez řídících počítačů by nemohla existovat konfokální mikroskopie ani dvoufotonová fluorescenční tomografie. Nejčetnější jsou však aplikace kombinující výpočetní techniku s moderními CCD kamerami, které mohou dnes snímat mikroskopické obrazy s rozlišením 4096 × 4096 pixelů. Klasické fotografické snímky jsou postupně vytlačovány digitálními obrazy získanými pomocí CCD kamer a počítačů. K tomu přistoupily možnosti kvantitativního zpracování digitálních mikroskopických snímků, které zahrnuje např. identifikaci a počítání objektů v zorném poli, měření jejich velikosti či zařazování do vybraných tříd podle předem definovaných vlastností. Časté je kvantitativní rozdílové nebo poměrové porovnání dvou mikroskopických snímků, například při měření nitrobuněčné koncentrace Ca²⁺ nebo pH pomocí fluorescenčních sond. Méně běžné je doostřování snímků digitálními filtracemi pomocí speciálních matematických postupů (Fourierovy nebo waveletové transformace) či vyloučení rozostřených rovin pomocí detekce hran. Druhý postup se úspěšně používá pro série obrazů, které byly pořízeny při postupném přeostřování mikroskopu po malých svislých krocích („malý krok“ zde znamená „blížící se hloubce ostrosti mikroskopu“). Jestliže digitálně vyloučíme rozostření, můžeme dohromady složit celé série snímků a vytvořit tak mikroskopický obraz, který překročí fyzicky dosažitelnou hloubku ostrosti. Takové série snímků umožňují trojrozměrnou rekonstrukci mikroskopického objektu, a ten si můžeme prohlížet při libovolném natočení, popřípadě i ve stereoskopickém provedení. Principiálně korektnější a snad i spolehlivější je potlačit nezaostřené obrazy výpočtem – dekonvolucí s využitím funkce bodového rozmazání (PSF – Point Spread Function). ¹⁰⁾ Optické řezy vzorkem získané dekonvoluční metodou jsou plně srovnatelné s konfokální mikroskopií. U slabě fluoreskujícího cytoskeletu značeného fluorescenčními protilátkami ji dokonce předčí. Hlavní přednost dekonvoluční metody však spočívá v tom, že její použití není na rozdíl od konfokální mikroskopie omezeno na fluoreskující vzorky. Zřejmou nevýhodou je časová náročnost dekonvoluce série snímků, která se musí provést velkým počtem postupně opakovaných kroků.
• Revoluční změnu digitálního zvětšování hloubky ostrosti mikroskopických snímků tlustých vzorků představuje metoda využívající optiku s kódovanou vlnoplochou (Wavefront Coded Optics), která umožňuje zvětšit hloubku ostře zobrazeného pole více než 10× oproti mikroskopu s klasickým uspořádáním optického systému (viz www.colorado.edu/ isl/intimages.html). Vynález optických systémů s kódovanou vlnoplochou, patentovaných r. 2000 americkou firmou CDM Optics Inc., byl inspirován matematickými algoritmy z radarových systémů. ¹¹⁾ Optické systémy s kódovanou vlnoplochou využívají – zdánlivě paradoxně – cílené rozmazání primárního obrazu, který vytváří objektiv. Toto rozmazání vyžaduje úpravu optické soustavy – je třeba vložit za objektiv speciální fázovou desku. Půvab přidaného rozmazání spočívá v tom, že výsledná funkce bodového rozmazání nezávisí v dostatečně širokém rozmezí na vzdálenosti zobrazované roviny od objektivu. Veškeré rozmazání lze pak odstranit vcelku jednoduchým přepočtem (jednostupňovou digitální dekonvolucí), jež u velkých snímků trvá pouhé sekundy, tedy je více než desetkrát rychlejší oproti snímání ekvivalentní série optických řezů pomocí konfokální mikroskopie. I při použití silně zvětšujících objektivů o velké numerické apertuře činí tloušťka ostře zobrazené vrstvy až 10 mikrometrů, a to bez snížení rozlišovací schopnosti objektivu vůči hodnotě dosahované při jeho běžném použití. Až se vyřeší ekonomické záležitosti okolo patentových práv, stanou se optické systémy s kódovanou vlnoplochou během jedné dekády standardní součástí moderních mikroskopů.

  Vedle metod eliminujících mimoohniskové rozmazání existují speciální numerické filtrace digitálních mikroskopických obrazů, které (někdy v kombinaci s důmyslnými osvětlovacími metodami) překračují Abbeovu mez rozlišovací schopnosti. Výklad těchto metod je však mimo rozsah krátkého souhrnu (viz www.opticsinfobase.org/ocisdirectory/100_ 6640.cfm). Kromě vývoje nových zobrazovacích metod se optický mikroskop uplatnil v několika posledních desetiletích i jiným způsobem. Stal se z něj nejen speciální měřicí přístroj, ale i mikromanipulační nástroj. Kromě měření difuzního pohybu mikroskopických objektů a makromolekul metodami FRAP a FCS jde např. o optickou pinzetu, umožňující měřit pikonewtonové síly potřebné k deformaci izolovaných molekul DNA a proteinů či síly související s činností molekulárních motorů. Přikladem nástroje pro manipulaci s mikroskopickými vzorky je zařízení pro bezkontakní laserovou mikrodisekci buněčných organel i jednotlivých chromozomů, které lze pomocí přesně zaostřeného laserového paprsku řezat, oddělovat a transportovat s extrémně vysokou přesností. K některým z těchto metod se ve Vesmíru ještě vrátíme.