Separace, detekce a identifikace mikroorganismů pomocí kapilárních elektroforetických technik

Elektroforetické techniky využívají pro separaci nabitých částic jejich pohybu účinkem stejnosměrného elektrického pole. Analyty jsou buď separovány na základě svých rozdílných migračních rychlostí kapilární zónovou elektroforézou (CZE), nebo na základě rozdílných izoelektrických bodů kapilární izoelektrickou fokusací (CIEF). Zatímco migrační rychlost mikroorganismu v kapiláře je významně ovlivněna složením média, v němž se elektroforéza provádí, hodnota jeho izoelektrického bodu na vnějším prostředí nezávisí. Při CIEF migrace mikroorganismů probíhá v prostředí pH gradientu, který je vytvořen působením elektrického pole na komplexní směs komerčních amfolytů, tj. látek nesoucích kladné i záporné náboje v závislosti na pH prostředí a hodnotě vlastního izoelektrického bodu. Buňky migrují v kapiláře až na to místo pH gradientu, kde je lokální pH rovno pI mikroorganismu, a tedy náboj buňky je nulový. Takto fokusované zóny je pro detekci třeba mobilizovat, což se provádí buď interně v přítomnosti „kontrolovaného“ elektroosmotického toku (EOF), nebo externě hydrodynamickým tokem či elektroelucí, obojí v případě eliminace EOF vhodnou modifikací vnitřního povrchu kapiláry. Elektroosmotický tok vzniká působením stejnosměrného elektrického pole na difúzní část elektrické dvojvrstvy na rozhraní pevné a kapalné fáze u vnitřní stěny neupravené křemenné kapiláry. Velikost EOF je možno do jisté míry regulovat přídavkem různých aditiv do separačních elektrolytů, anolytu a katolytu, popř. opět úpravou vnitřního povrchu kapiláry vedoucí ke snížení EOF. Předností mobilizace pomocí EOF ve srovnání s hydrodynamickým tokem je takřka pravoúhlý rychlostní profil, a tedy minimální příspěvek k celkové disperzi zón mikroorganismů. Po separaci jsou analyty detekovány buď UV detektorem, nejčastěji při 280 nm, nebo detektorem fluorescenčním za použití ionogenních (CZE) nebo neionogenních barviv (CZE, CIEF). Při využití fluorescenční detekce se dosahuje o tři řády vyšší citlivosti detekce (~104 buněk v 1 ml vzorku) než u detekce UV. Přesto i tato citlivost je nedostačující v případě vážných krevních infekcí, kde je požadovaná citlivost ještě o 2 až 3 řády nižší.