Jak nakoupit elektronový mikroskop

Panuje všeobecný souhlas s tím, že kvalitní přístrojové vybavení, tedy i mikroskopické, je pro dosažení konkurenceschopnosti vědeckých výstupů podmínkou nutnou, ovšem nikoli postačující. Moderní mikroskopy se neskládají jen z „holého“ mikroskopu, ale také z řady doplňků, zpravidla drahých. Motivací k sepsání tohoto článku je opodstatněný dojem, že pro některé zahraniční, ale i naše vědecké skupiny, které používají mikroskopy, se získání výkonného (a drahého) mikroskopu stalo vytouženým cílem a priori. V diskusích o parametrech mikroskopu může zůstat bez povšimnutí, zda je daný typ mikroskopu účelný a využitelný na daném pracovišti.

V tomto příspěvku se budu věnovat výlučně prozařovacím elektronovým mikroskopům. Zdůrazňuji, že tomografie a pozorování nativních kryopreparátů znovuoživily zájem o biomedicínsky zaměřenou elektronovou mikroskopii. Nativní kryoelektronová mikroskopie se stále více ukazuje jako nepostradatelný partner krystalografických a jiných strukturních přístupů se zásadním přesahem do nanotechnologií. V buněčné biologii bude elektronová mikroskopie i v budoucnu poskytovat nesrovnatelně vyšší rozlišení než mikroskopie světelná, navíc ji lze v korelační světelné a elektronové mikroskopii kombinovat se světelnou mikroskopií živých buněk.

Výběr prozařovacího elektronového mikroskopu se musí řídit především vědeckými projekty příslušného pracoviště. Pokud by pracoviště zjišťovalo výlučně změny ultrastruktury buněk a tkání v biopsiích pacientů či přítomnost rotavirů ve stolici pacientů včetně provedení ultrastrukturálního imunocytochemického značení, postačil by na všechny tyto aplikace mikroskop Morgagni vyráběný v Brně nebo výkonnostně podobné mikroskopy jiných firem.

Snaha dosáhnout maximálního rozlišení mikroskopu je zcela zavádějící. U špičkových mikroskopů je maximální rozlišení v řádu 0,1 nm. Je však docilováno na nebiologických preparátech, jakými jsou například krystalická uspořádání atomů těžkých prvků. Pro biologické aplikace s ultratenkými řezy se i ve špičkových mikroskopech dosahuje reálného, biologicky významného rozlišení, které je nejméně o jeden, ale spíše o dva řády horší. Mluvím-li o buněčných strukturách, velmi si považuji tomografické rekonstrukce jedné z nejsložitějších buněčných struktur, jaderného póru, a to v prostorovém rozlišení (tedy ve všech směrech) 9 nm (viz Science 306, 1387–1390, 2004). Tohoto výsledku však bylo dosaženo nikoli na celých buňkách, ale na izolovaných, nicméně stále transportně aktivních jádrech hlenky (Dictyostelium), jejíž jádra byla vybrána pro jejich malý rozměr. Izolovaná jádra byla rychlým zmrazením vitrifikována („zasklena“) a v elektronovém mikroskopu s kryonástavcem byla tomografie provedena pouze na okraji jádra, tj. v oblasti o dostatečně malé tloušťce. Výsledky tomografické rekonstrukce získané na více jaderných pórech byly nakonec počítačově zprůměrovány.

Na rozdíl od ultratenkých řezů či izolovaných buněčných organel (např. buněčného jádra) lze na izolovaných drobných strukturách, jako jsou ikosaedrické viry pozorované v tenké vitrifikované vrstvě, dosáhnout biologicky významného rozlišení i pod 1 nm. ¹⁾ Zde se konkrétně tak vysokého rozlišení dosahuje s využitím mnohonásobné symetrie virové částice.

Nezasvěcenému čtenáři není známo, že při optimálním tomografickém snímkování jsou jednotlivé tomografické snímky pořízené kamerou vysoce „podexponovány“, takže ani zkušenému pozorovateli nic neříkají. To je však nutný postup, neboť biologický preparát, a především nativní kryopreparát, je na osvit elektrony vysoce citlivý (i při tomografii pryskyřičných řezů je nutné omezit intenzitu osvitu – viz obrázek 1). Avšak počítačová tomografická rekonstrukce vytvořená z několika desítek vysoce podexponovaných snímků je již dobře čitelná. Na našem pracovišti se zatím tomuto přístupu vyhýbáme, neboť příprava a analýza nativních hydratovaných kryořezů jsou náročné.

Dilema návrhu tomografického mikroskopu s urychlovacím napětím 200 kV Těm, kteří budou vybírat výkonný elektronový mikroskop pro biologické aplikace, prozradím myšlenkovou anabázi, jíž jsem musel projít, když jsem pro naše pracoviště navrhoval sestavu tomografického mikroskopu Tecnai s urychlovacím napětím 200 kV, kryonástavcem, dostatečně kvalitní (2×2k) CCD kamerou a modulem pro snímání při nízké dávce elektronů. K návrhu mne vedlo několik projektů, v nichž se využije vitrifikovaná kryovrstva při sledování s vysokým rozlišením nativní struktury komplexů biomakromolekul ²⁾ i při různých aplikacích v oblasti nanotechnologií. ³⁾ V molekulární buněčné biologii sem patří analýza imunocytochemicky značených replikovaných segmentů DNA ⁴⁾ nebo analýza složitějších biostruktur nevykazujících symetrii v tenké vitrifikované vrstvě, u nichž je již nutné provést tomografickou rekonstrukci. Musím ale zmínit, že rekonstrukci složitějších objektů lze rovněž provádět použitím velkého počtu jeho snímků, přičemž objekty jsou v tenké vitrifikované vrstvě náhodně orientovány; to však za předpokladu, že jsme schopni určit prostorovou orientaci objektů v tenké vrstvě.

Zásadním dilematem bylo, zda máme k mikroskopu požadovat energetický filtr. Takový filtr představuje velmi drahou nadstavbu, navíc bez další drahé investice – speciálního zdroje elektronů ⁵⁾ poskytujícího vysoce monochromatické elektrony – ztrácí do značné míry smysl. Ve srovnání se standardní katodou, emitující elektrony, vyžaduje provoz tohoto zdroje podstatně vyšší vakuum (více než o řád), což dále významně navyšuje cenu přístroje.

Energetický filtr umožňuje při tvorbě obrazu „vybrat“ elektrony jen o určité vlnové délce. Pro pochopení významu energetického filtru musím ve velmi zjednodušené formě zmínit způsob, jak elektrony interagují s preparátem a jak se vytváří obraz. Vysoce urychlené elektrony reagují s preparátem dvojím způsobem. Při tvorbě věrného obrazu se uplatňují elektrony, které jsou vychýleny jádry atomů v preparátu, aniž změní energii, tj. svoji vlnovou délku (mluvíme o pružném rozptylu). Elektrony dopadající na preparát mohou rovněž reagovat s elektronovým obalem atomů, přitom jsou rovněž vychýleny ze své dráhy, avšak ztrácejí energii (mluvíme o nepružném rozptylu). A navíc také dochází i k vícečetným interakcím elektronu v preparátu. Takto „nevhodně“ reagující elektrony zásadně přispívají k zničení struktury preparátu a zkreslení správného kontrastu biologických struktur v obraze. Vytvořený obraz tak přestává být věrný. Čím je preparát silnější, tím více se vytváří oněch nevhodných elektronů. A právě zde nachází uplatnění energetický filtr, který pro vytvoření obrazu propustí jen elasticky vychýlené elektrony. ⁶⁾

Situace není alarmující v případě tenké vitrifikované vrstvy, tenkých pryskyřičných řezů nebo rozmrzlých tenkých kryořezů (fixovaného materiálu) o tloušťce do 100 nm. U zpracování silnějších objektů, jako jsou pryskyřičné kontrastované řezy o tloušťce kolem 200 nm, které jsou již vhodným objektem pro tomografické zpracování, se situace stává složitější, nicméně lze stále snímky bez velkých problémů vyhodnotit. Pozitivně se při tom uplatňuje i vyšší urychlovací napětí 200 kV. ⁷⁾ Vyšší energie elektronů v mikroskopu s urychlovacím napětím 200 kV umožní nejen jejich průnik silnějším preparátem, ale navíc se ve srovnání s napětím 100 kV standardních elektronových mikroskopů zvýší relativní podíl elastických a nevhodných elektronů. Především podíl elektronů reagujících vícenásobně s preparátem významně klesá. V případě vysoce citlivých nativních kryořezů je situace již zcela kritická. Při tomografickém náklonu tenkého řezu o 60 i více stupňů se reálná tloušťka řezu pro dopadající elektrony významně zvýší, zvyšuje se tím počet nevhodných elektronů přispívajících k tvorbě obrazu a vzhledem k zanedbatelnému inherentnímu kontrastu vitrifikovaného (nekontrastovaného) kryořezu nelze výsledný obraz správně vyhodnotit. Je nutné použít energetický filtr. Podobná je situace s velkými vitrifikovanými objekty, jakým je izolované jádro hlenky.

Vzhledem k těmto všem skutečnostem jsem upustil od energetického filtru a od zdroje elektronů FEG s plánem využívat metody tenké vitrifikované vrstvy a tomografie složitějších biostruktur v tenké vitrifikované vrstvě, jakož i tomografie kontrastovaných pryskyřičných řezů o tloušťce kolem 200 nm. Takové řezy jsou již vhodné pro mnoho tomografických aplikací na buněčné úrovni. Mikroskop je samozřejmě využitelný pro ultrastrukturální imunocytochemii na pryskyřičných řezech či rozmrzlých ultrakryořezech a pro srovnávací světelnou a elektronovou mikroskopii včetně tomografie. Musím zdůraznit, že nezbytnou podmínkou pro využitelnost mikroskopu pak byla přítomnost doc. Jana Bednára na našem pracovišti; ten je mezinárodně uznávaným odborníkem na nativní kryo-elektronovou mikroskopii. Bez něho bych se nemohl do soutěže o tak výkonný a drahý mikroskop pustit.

Text je věnován památce Josefa Reischiga (*6. 8. 1945 – †10. 8. 2008).

Vznik sdělení byl podpořen granty MŠMT MSM0021620806 a LC535, AV ČR AV0Z5011050, Welcome Trustu 075834/04/Z, GAČR304/05/2168, GAČR304/06/1662, GAČR304/06/1691 a GAUK 13308.