Genetické zaměřování

Nobelova cena za fyziologii a medicínu byla roku 2007 udělena Mariovi R. Capecchimu, Martinu J. Evansovi a Oliveru Smithiesovi za objevy, které před dvaceti lety vytvořily podmínky pro vznik genetického zaměřování (gene targeting). Průlomem na tomto poli bylo propojení výzkumu rekombinace DNA u savců se základním výzkumem embryonálních kmenových buněk. Mnoho biologických oborů bylo schopno vyvinutou technologii okamžitě použít a definovaným způsobem obměnit savčí genom. Výsledkem téměř dvacetileté aplikace objevů těchto tří laureátů Nobelovy ceny je přes 10 000 inaktivovaných genů (tudíž 10 000 kmenů myší s příslušnou modifikací genomu), které představují přibližně polovinu genů myšího (ale i lidského) genomu. Brzy zřejmě bude dosaženo kompletního pokrytí všech známých myších genů. Umlčení genu (knock-out) ¹⁾ však není jediným využitím této technologie.

Myší genom je možné obměňovat různými způsoby – např. vyměňovat genové varianty za původní verze (mutované, připojené k fluo rescenčnímu proteinu, fúzované s jinými geny). V tomto uspořádání se cílový gen neumlčuje, ale vyměňuje (říká se tomu knock-in). Tak se podařilo připravit více než 500 různých myších modelů lidských chorob, včetně kardiovaskulárních, neurodegenerativních, cu krovky nebo jednotlivých typů nádorů. Vraťme se však na začátek, do doby, kdy byly formulovány první otázky.

Dá se homologní rekombinací obměnit savčí genom?

Většina z nás ví, že se při meióze během vzniku pohlavních buněk kombinují genetické informace mezi chromozomy získanými od otce a od matky. Při 1. meiotickém dělení se propojí, překříží, naštěpí a vymění části příslušných vláken chromozomu. Tímto procesem – homologní rekombinací – vzrůstá genetická variabilita v populaci. Za objev homologní rekombinace u bakterií získal roku 1958 Nobelovu cenu Joshua Lederberg.

Cesta k loňské Nobelově ceně začala u Richarda Axela (Nobelova cena r. 2004 za objev čichových receptorů), který ukázal, že kultury savčích buněk defektních v tymidinkináze mohou enzymatickou aktivitu získat zpět začleněním genu pro tymidinkinázu z genomu herpetického viru.

Mario Capecchi a Oliver Smithies měli na začátku osmdesátých let 20. století dost indicií na to, aby nezávisle na sobě dospěli k přesvědčení, že homologní rekombinaci lze využít pro cílené ovlivňování genomu. M. Capecchi nejprve vylepšil začlenění cizorodé DNA do hostitelského genomu tím, že příslušnou DNA injikoval do jádra. Účinnost genového přenosu prudce vzrostla a novou metodu převzali všichni, kteří se snažili připravit transgenní myši. V té době přišel na americký Federální ústav zdraví s projektem, v němž chtěl testovat možnost homologního začlenění DNA do genomu savčích buněk. Na projekt ale nezískal grant, neboť hodnotitelům se zdálo nepravděpodobné, že by si nově vnesená sekvence našla odpovídající sekvenci v genomu.

S podobným záměrem a podobně odmítavou reakcí se v téže době setkal Martin Evans v britské Lékařské výzkumné radě. Ani jednoho z badatelů však odmítnutí neodradilo a brzy dosáhli významných objevů. V roce 1986 Capecchi publikoval práci, v níž popsal opravu defektu v modelovém genu pro neomycinovou rezistenci, a to s frekvencí 1 na 1000 ovlivněných buněk.

V téže době Oliver Smithies prokázal molekulární mechanizmus homologní rekombinace. Vyhráno však ještě nebylo. Všechny experimenty se totiž prováděly na tkáňových kulturách a nevědělo se, zda je možné podobně pracovat i s buňkami umožňujícími vznik geneticky modifikované myši.

V jakých buňkách lze provést homologní rekombinaci?

Buněčné typy, které původně používali Capecchi a Smithies, nemohou být použity pro přípravu geneticky modifikovaných zvířat. K tomu je potřeba provádět homologní rekombinaci v buňkách, které se mohou diferencovat v pohlavní buňky. A tehdy vstoupil do hry Martin Evans. Původně pracoval s myšími embryonálními karcinomovými buňkami, které mohou diferencovat do téměř libovolného buněčného typu. Mají však množství chromozomálních abnormalit a není možné je využít pro přípravu životaschopného reprodukujícího se jedince. Náhrada se našla brzy – buněčné kultury je možné založit přímo z časných myších embryí. Tyto buňky jsou dlouhodobě kultivovatelné a je možné je vnést zpět do vyvíjejícího se časného embrya. Zde pak využijí svůj diferenciační potenciál a dají vzniknout libovolnému buněčnému typu včetně buněk pohlavních. ²⁾

Dnes tyto buňky označujeme jako embryonální kmenové. Jako kmenové obecně pak označujeme ty, které jsou schopny opakovaně se dělit, čímž vznikají další kmenové buňky a vedle toho diferencující se buněčné populace. Pokud se tyto buňky vyskytují v dospělém těle, jde o kmenové buňky nezbytné pro obnovu tkání.

Všeobecně známé jsou krvetvorné buňky v kostní dřeni, jejichž dělením a diferenciací části dceřiných buněk vznikají různé typy bílých krvinek, červené krvinky či krevní destičky. Somatické kmenové buňky jsou schopny se diferencovat do více či méně typů, ale nikdy neumožňují vznik všech buněčných typů vyskytujících se v těle – „všehoschopné“ buňky jsou pouze v časném embryu.

O tom, že diferencované buňky a tkáně vznikají z nediferencovaných kmenových buněk, se vědělo již před sto lety. Teprve v osmdesátých letech 20. století však byly kmenové buňky objeveny a využity. V roce 1980 se Martin Evans spojil s embryologem Mattem Kaufmanem, aby svou znalost kultivace embryonálních buněk propojil s jeho metodami vnášení materiálu do vyvíjejícího se embrya. Společně publikovali své poznatky o embryonálních kmenových buňkách v červnu 1981 (Nature 292, 154–156, 1981). V dalším článku (Nature 309, 255–256, 1984) popsali přenos embryonálních kmenových buněk do myšího embrya a prokázali jejich schopnost produkovat buňky zárodečné linie – spermie a vajíčka. Po tomto objevu byl jen krok k pokusu záměrně obměnit genetickou informaci embryonálních kmenových buněk, a ty pak vnést do embrya. K tomu Evans se spolupracovníky využil retrovirovou DNA a skutečně u experimentálních myší prokázal začlenění cizorodé DNA do zárodečné linie. V jednom ze svých následných článků Evans poukázal na možnost specificky změnit endogenní geny myšího genomu homologní rekombinací a citoval v té souvislosti Capecchiho a Smithiese.

První myš s vypnutým genem

V roce 1986 bylo vše připraveno pro vytvoření embryonálních kmenových buněk s ge ny obměněnými homologní rekombinací. Mario Capecchi a Oliver Smithies ukázali, že cílové geny je možné v buňkách obměňovat homologní rekombinací, zatímco Evans etabloval model embryonálních kmenových buněk. Capecchi a Smithies si byli vědomi objevů Martina Evanse s embryonálními kmenovými buňkami a rozhodli se tento jeho model využít. Prvním genem, který si zvolili pro vnesení pomocí homologní rekombinace do embryonálních kmenových buněk, byl gen odpovědný za velmi vzácný LeschůvNyhanův syndrom, jehož fenotyp může být snadno vysledován. A když se jim to zdařilo, bylo k dispozici vše pro vytvoření myších kmenů s genomem obměněným sekvencemi DNA vnesenými homologní rekombinací. Do závodu o první upravenou myš se pustilo několik laboratoří a v roce 1989 se narodilo několik knokautovaných myší.

Tím začala jedna z revolucí v buněčné, molekulární a vývojové biologii. Dnes je možné v podstatě ovlivňovat geny, kdy chceme, ve vybraných buňkách nebo tkáni, v embryu nebo v dospělém zvířeti. Cílené obměny genomu homologní rekombinací v buňkách schopných ustanovit zárodečnou linii ovlivnily i biomedicínské obory, jejichž bouřlivý rozvoj si bez myší s vypnutým nebo vyměněným genem dnes již neumíme představit. Technika zásahů do myšího genomu je dnes natolik zvládnutá, že teoreticky je možné si představit korekce genetických defektů u člověka. To je ale už jiná otázka – možná víc etického než biologického charakteru.

MARIO R. CAPECCHI

(*6. 10. 1937 v italské Veroně) po druhé světové válce emigroval s matkou do USA. V roce 1967 dokončil doktorát na Harvardově univerzitě pod vedením Jamese D. Watsona. Od sedmdesátých let působí na Utažské univerzitě jako profesor genetiky. Jeho výzkum objasnil roli některých genů zapojených do vývoje savčích orgánů a ustanovení tělního plánu. Zásadním způsobem přispěl k pochopení molekulárního mechanizmu vrozených vývojových vad a nemocí.

Sir MARTIN J. EVANS

(*1. 1. 1941 ve Stroudu, hrabství Gloucestershire) v roce 1963 absolvoval Cambridžskou univerzitu. Doktorát z anatomie a embryologie získal r. 1969 na Londýnské univerzitě. Od roku 1999 působí na Univerzitě v Cardiffu, kde vede katedru přírodních věd a přednáší genetiku savců. Zapojil se do přípravy myších modelů lidských chorob. Postupně vytvořil a zevrubně charakterizoval několik modifikovaných myší pro studium mechanizmů a terapie cystické fibrózy. R. 2003 byl povýšen do šlechtického stavu.

OLIVER SMITHIES

(*23. 7. 1925 v Halifaxu v západním Yorkshiru) získal doktorát z fyziologie a biochemie r. 1951 na Oxfordské univerzitě. Brzy odešel do USa a téměř 30 let působil na Wisconsinské univerzitě. Od roku 1988 je profesorem patologie a laboratorního lékařského výzkumu na Severokarolínské univerzitě. V roce 2003 obdržel prestižní Wolfovu cenu za medicínu. Použil homologní rekombinaci v embryonálních kmenových buňkách pro přípravu myších modelů dalších lidských chorob, a to (opět) cystické fibrózy, talasemie, hypertenze, aterosklerózy.