Aktuální číslo:

2017/12

Téma měsíce:

Kontakty

Umlčování genů aneb Co dokáže malá RNA

 |  14. 4. 2005
 |  Vesmír 84, 198, 2005/4

Donedávna se myslelo, že DNA a proteiny jsou hlavní hybatelé života a RNA plní většinou jen funkci zprostředkovatele mezi nositelem návodu – DNA – a vykonavatelem – proteinem. A ejhle, v poslední době se ukazuje, že jakési malé RNA mohou ovládat činnost genů umlčováním jejich exprese, a to hned na několika úrovních. Nejnovější poznatky naznačují, že tímto způsobem je kontrolována funkce nejméně třetiny lidských genů.

Sláva kvasinky Saccharomyces cerevisiae jako prvotřídní modelky pro genetická studia pochodů na úrovni eukaryotické buňky je mimo jiné založena na vlastnosti, kterou se kvasinka od vyšších eukaryotických organizmů výrazně liší. Je to přebujelá homologní rekombinace, 1) která dovoluje cílené úpravy včetně úplné eliminace libovolného genu, respektive sekvence DNA. Tím se otvírá brána k systematickému studiu úloh jednotlivých genů a jiných nukleotidových sekvencí v životě kvasinkové buňky. Úplným odstraněním (delecí) genu vytrhneme stromek genového vyjádření (exprese) i s kořeny. Není-li gen, nemůže se pochopitelně projevit ani enzymová, regulační, stavební či jiná aktivita jeho konečného produktu – proteinu nebo RNA. Poškození genu však není jediný způsob jak zabránit jeho vyjádření. Pouť genetické informace od DNA k proteinu je dlouhá, a není tudíž divu, že existuje mnoho míst vhodných k umlčování. Expresi genu lze v eukaryotické buňce přerušit v kterémkoli z jednotlivých kroků procesu (obrázek).

Mezi nejatraktivnější zůsoby jak přerušit tok informace patří RNA-interference (RNAi), která umlčuje vyjádření genu po transkripci, tj. poměrně brzy. Co to znamená? Vpravíme-li určitou dvouřetězcovou RNA (dsRNA) např. do ocásku elegantní hlístice Caenorhabditis elegans (viz Vesmír 82, 133, 2003/383, 167, 2004/3), umlčíme určitý gen nejen v okolí vpichu, ale také ve vzdálených oblastech, kam interferující RNA spontánně a bez problémů pronikne. Úžasné je to, že na rozdíl od cíleného vytvoření delečního mutanta postupem, který je snadný jen u kvasinek a několika dalších výjimečných tvorů, je umlčování pomocí RNA mnohem univerzálnější. Navíc gen může zůstat nepoškozen, naděje na obnovu jeho exprese tedy přetrvává.

Potranskripční umlčování genů, které se původně považovalo za vzácný jev, se stalo horkým tématem současné molekulární biologie. Schopnost dvouřetězcové nebo vlásenkovité RNA vyvolat destrukci odpovídající homologní mediátorové RNA je dnes jedním z nejdůležitějších nástrojů molekulárních biologů zabývajících se eukaryotickými organizmy. Jde asi o starobylý mechanizmus protivirové obrany, který brání také přeskokům transpozonů, a samozřejmně i o způsob regulace vlastních genů. Umlčování genů při interferenci RNA můžeme charakterizovat:

  • účinné agens je dsRNA,
  • účinek je vysoce specifický,
  • pro rozsáhlý následek stačí pár molekul dsRNA,
  • molekuly dsRNA působí alespoň u některých organizmů i na buňky velmi vzdálené od místa vstupu dsRNA do organizmu.

Objev tohoto jevu pochází z roku 1998. 3) Poprvé byla dsRNA pro umlčení genů destrukcí homologní mRNA použita na Caenorhabditis elegans. Brzy se ukázalo, že tento zázračný mechanizmus lze využít i u dalších eukaryotických organizmů. Dnes se již věří, že dsRNA může umlčovat geny většiny eukaryotických organizmů včetně kvasinek a člověka.

Příprava dsRNA kopie úseku dsDNA in vitro není pro genového inženýra složitým úkolem. V souvislosti s umlčováním se osvědčily např. systémy využívající dvojici bakteriofágových RNA-polymeráz, které rozeznávají promotory např. u genů kolifága T7 nebo T3. Expresní vektor umožňující transkripci in vitro musí obsahovat úsek bohatý na restrikční místa, obklopený promotory T7 a T3 z obou stran (obrázek). Do vybraného restrikčního místa se vloží komplementární DNA (cDNA) odvozená od zvolené mRNA. Takto vzniklá rekombinantní DNA slouží jako matrice pro syntézu obou řetězců dsRNA in vitro. 4) Za vhodných podmínek se oba získané komplementární řetězce spontánně spojí podle zákona komplementarity, a tím vznikne dvouřetězcová RNA. Existují údaje, které ukazují, že určitý nespecifický inhibiční efekt se může dostavit i u genů, které jsou identické jen asi z 80 % v nukleotidové sekvenci.

Když vpravíme tuto RNA do organizmu (obrázek), rozštěpí se v buňkách na úseky dlouhé 21–23 nukleotidů (siRNA), a to za pomoci nukleázy zvané Dicer. Potom se vytvářejí tzv. RISC-komplexy 5) těchto krátkých úseků (siRNA) s nukleázami, které nakonec naštěpí mRNA. Při pohledu na schéma (obrázek) snáze pochopíme, proč je tato RNAi považována za způsob potranskripčního umlčování. Množí se však údaje o tom, že dsRNA může působit ještě jinak.

O čem nás poučily kvasinky?

Již dříve jsme si ukázali, že modelová kvasinka Saccharomyces cerevisiae nám díky své zvýšené homologní rekombinaci umožňuje snadno umlčet jakýkoliv gen, a to buď cílenou delecí, nebo cíleným přerušením prostřednictvím vloženého jiného genu. Umlčování genů na základě interference RNA dosahuje obdobného výsledku, tj. ruší funkci genu, a to i v organizmech, které nám neposkytují výhody přebujelé homologní rekombinace. Byly to však opět experimenty s kvasinkami, tentokrát Schizosaccharomyces pombe, které přinesly novýpohled na umlčující účinek dsRNA.

Určité oblasti eukaryotických genomů se vyznačují velkým počtem opakování sekvencí nukleotidů. Takové oblasti často přiléhají k centromerám, které hrají rozhodující roli při mitotickém rozchodu chromozomů. Přeskokům transpozonů vložených do těchto oblastí může zabránit vysoce kompaktní chromatin. Vznik tohoto tzv. tichého chromatinu vyžaduje deacetylaci histonu H3 a jeho následnou metylaci na lyzinu. 6)

Interference RNA zahrnuje u S. pombe funkce několika složek, které pravděpodobně hrají roli při degradaci dsRNA na siRNA. Jsou to již dříve zmíněná Dicer-nukleáza, protein argonaut a RNA-dependentní RNA–polymeráza (Rpd1). Delece kteréhokoliv z genů kódujících tyto proteiny vede ke ztrátě schopnosti vytvořit tichý chromatin, což svědčí pro to, že interference RNA je součástí širšího mechanizmu, který může dokonce umlčovat geny již na úrovni zahájení transkripce (obrázek). 7)

Umlčování genů jako terapie dědičných chorob

V červenci 2004 se objevila zpráva o úspěšné terapii myši, která strádala spinocerebelární ataxií, dědičnou chorobou, jež je způsobena dominantní mutantní alelou genu SCA1. V důsledku této mutace produkují specifické buňky v mozečku toxický protein způsobující pohybové obtíže. Beverly Davidson a spolupracovníci z Iowské univerzity úspěšně umlčeli mutovaný gen pomocí interference RNA. Interferující RNA (siRNA) působila přímo v mozku pět týdnů staré myši. Po šesti týdnech terapie neměla již myš žádné pozorovatelné obtíže a neobjevily se ani žádné vedlejší účinky.

Tyto výsledky naznačují, že by se podobné postupy daly využít i při léčbě některých lidských dědičných chorob. Navíc je pravděpodobné, že techniky umlčování založené na aplikaci dsRNA budou alespoň v některých případech mnohem lepší pro léčení následků genetických poruch než terapie, která je založena na aplikaci DNA.

Poznámky

1) Zvláštností mnoha kvasinkových druhu je jejich schopnost rekombinovat s vysokou frekvencí dvě molekuly DNA, které obsahují alespoň relativně krátké úseky se stejnou sekvencí nukleotidů. Protože se takové úseky označují také jako homologní, mluvíme o homologní rekombinaci (Vesmír 83, 612, 2004/11).
2) V angličtině je zkratka mRNA odvozena od slova messenger (posel), proto jsem zvolil slovo poslíček do nadpisu této kapitoly. V češtině je tomu trochu jinak, neboť mRNA se čte správně jako mediátorová RNA. Latinské slovo mediátor (prostředník) i anglické slovo messenger názorně vyjadřují roli, jakou mRNA (stejná zkratka i obsah pojmu) hraje při přenosu genetické informace od DNA k proteinu. U vzniku této zdánlivé krkolomnosti jsem byl přítomen. Šlo o to zachovat mezinárodně uznávanou zkratku mRNA a odvodit ji od latinského slova, protože z latiny běžne slova do češtiny přejímáme, zatímco anglicizmům se tehdy ješte naše mateřština bránila. Autorem vtipného řešení byl myslím náš významný genetik, profesor Jan Nečásek. Dnes je situace jiná. Invaze anglicizmů již dávno vědeckou i technickou češtinu převálcovala.
3) A. Fire et al., Nature 391, 806–811, 1998.
4) Do systému musíme přidat prekurzory syntézy RNA a obě RNA-polymerázy ve vhodném transkripčním pufru.
5) V anglické terminologii RNA-induced silencing komplex.
6) U některých kvasinek se udržuje repetitivní DNA u centromer v tichém stavu tak, že protein Swi 6 se váže na metylovaný H3 lyzin 9, a tím se udržuje chromozom v kompaktním uspořádání, což se kromě jiného projevuje i umlčením transkripce genu v této oblasti. Kdyby se transkripci okolo centromer nezabránilo, narušila by se funkce centromery jako součástky aparátu zajištujícího správnou reprodukci a rozchod chromozomu.
7) Science 297, 1833, 2002.

SLOVNÍČEK

centromera – úsek chromozomu držící pohromadě sesterské chromatidy; úsek DNA pro připojení mikrotubulů mitotického vřeténka (Vesmír 84, 138, 2005/3)

delece – ztráta úseku chromozomu

genová exprese, genové vyjádření – celý proces od přečtení genetické informace DNA až po „výrobu“ bílkoviny

promotor – sekvence v DNA, na niž se navazuje RNA-polymeráza, která zajistí transkripci přilehlého genu

rekombinace – proces, při němž jsou chromozomy nebo molekuly DNA rozštěpeny na fragmenty, které jsou znovu pospojovány, ale jinak

dsRNA – dvouřetězcová RNA

mRNA – informační nebo mediátorová RNA řídí vznik bílkoviny v ribozomu, viz heslo translace

RNAi – interference RNA je proces, při kterém dochází k sekvenčně specifickému umlčení genu za pomoci homologní dsRNA

vlásenkovitá RNA – jednořetězcová RNA tvaru vlásenky, má dvě poloviny komplementární, takže vytváří dvojšroubovici spinocerebelární ataxie – dědičné onemocnění míchy a mozečku způsobující těžké poruchy koordinace pohybů, poruchy citlivosti ad.

transkripce – součást genové exprese, která spočívá v kopírování jednoho vlákna DNA do komplementární sekvence RNA za pomoci enzymu RNA-polymerázy, předchází translaci

translace – součást genové exprese, při níž se pořadí nukleotidů v RNA převádí do pořadí aminokyselin v bílkovině, odehrává se na ribozomech, do nichž informaci přináší mediátorová RNA, následuje po transkripci

transpozon – transponovatelný, přemístitelný element; úsek DNA, který se může v rámci genomu přemístit jinam

Ke stažení

OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Genetika

O autorovi

Vladimír Vondrejs

Doc. RNDr. Vladimír Vondrejs, CSc., (*1937) vystudoval chemii na Přírodovědecké fakultě UK v Praze. Na několika vysokých školách v Čechách a na Slovensku zaváděl výuku molekulární biologie. Na katedře genetiky a mikrobiologie PřF UK zavedl genové inženýrství. Postupně se věnoval výzkumu buněčného cyklu, rozvoji metod genových modifikací a reparaci DNA u mikroorganismů. S velkým zaujetím se ve volném čase věnuje malování a sochaření.

Doporučujeme

Přemýšlej, než začneš kreslit

Přemýšlej, než začneš kreslit

Ondřej Vrtiška  |  4. 12. 2017
Nástup počítačů, geografických informačních systémů a velkých dat proměnil tvorbu map k nepoznání. Přesto stále platí, že bez znalosti základů...
Tajemná „Boží země“ Punt

Tajemná „Boží země“ Punt uzamčeno

Břetislav Vachala  |  4. 12. 2017
Mnoho vzácného zboží starověkého Egypta pocházelo z tajemného Puntu, kam Egypťané pořádali časté obchodní výpravy. Odkud jejich expedice...
Hmyz jako dokonalý létací stroj

Hmyz jako dokonalý létací stroj

Rudolf Dvořák  |  4. 12. 2017
Hmyz patří k nejdokonalejším a nejstarším letcům naší planety. Jeho letové schopnosti se vyvíjely přes 300 milionů let a předčí dovednosti všech...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné