České pivovary a Univerzita Karlova

Nehodlám se zabývat zajímavou časovou shodou mezi založením Univerzity Karlovy a staropražského pivovaru U sv. Tomáše (1358) ani blízkostí současné biologické sekce Přírodovědecké fakulty UK a místa, kde stávala pověstná putyka Jedová chýše, dokonce ani nebudu psát o hospodě Uterus, v níž dozněla řada seminářů a vědeckých diskusí. Chtěl bych se zaměřit na to, jak pivovary v osmdesátých a částečně i devadesátých letech pomáhaly na Karlově Univerzitě rozvíjet vědu a co z toho vzešlo.

Pivo zabiják

Na přelomu sedmdesátých a osmdesátých let přišla na katedru genetiky a mikrobiologie nová vedoucí prof. O. Bendová, která byla předtím ředitelkou Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského. Tento malý přesun mezi dvěma na sebe navazujícími ulicemi, z Lipové do Viničné, nesporně usnadnil komunikaci Přírodovědecké fakulty s pivovary. Do té doby se na katedře genetiky a mikrobiologie zaměřoval výzkum pouze na bakterie a bakteriofágy a výuka mikrobiologie, která inklinovala k biochemii a molekulární biologii, se soustřeďovala také na tyto organizmy. Bylo to v souladu s tehdejším stavem vývoje molekulární biologie, protože ten pro začátek vyžadoval co nejjednodušší prokaryotické modely. Většina výzkumu se dělala na Escherichia coli, a nanejvýš občas odbočila na fágy parazitující na této bakterii.

V osmdesátých letech však již bylo jasné, že molekulární biologie musí sáhnout blíže k člověku, po modelech komplikovanějších, eukaryotických. Kvasinky byly nejrozumnější volbou. Nejlépe prostudovaným druhem z genetického hlediska byla kvasinka Saccharomyces cerevisiae. Paní profesorka ale pochopitelně chtěla odstartovat projekt na kvasinkách pivovarských, které se tehdy zařazovaly do druhu Saccharomyces uvarum. ¹⁾ Když jsem byl osloven, abych pro tuto oblast navrhl téma, vyšel jsem z toho, že paní profesorka má zkušenosti s kvasinkami produkujícími zymociny (viz Vesmír 64, 488, 1985/9). Problémem pivovarů byla v té době kontaminace a pasterace chuť piva poněkud zhoršuje. Co takhle vyrobit pivovarské kvasinky, které by kontaminaci likvidovaly samy?

U Saccharomyces cerevisiae byly již tehdy známy kmeny produkující zymociny (proteiny usmrcující citlivé kvasinkové kmeny), vůči svým vlastním zymocinům však byly odolné. Zabijácké kvasinky (killer-kmeny) nesly informaci pro zymocin a imunitu k tomuto zymocinu nejčastěji na dvojřetězcové RNA v cytoplazmatických partikulích, které nápadně připomínají viry.

Kvasinkové viry jsou však zvláštní nejsou infekční. Do dalších buněk se přenášejí při dělení, sexuální hybridizaci, indukované fúzi protoplastů, popř. různými jinými umělými způsoby, ale v žádném případě neničí buňky ani aktivně nenapadají buňky ve svém okolí. Pěkně se množí společně s buňkami, tak trochu jako proviry. Naše představa byla vyrobit pivovarský zabijácký kmen, který by produkoval zymocin usmrcující různé druhy kvasinek, tedy všechny kvasinkové kontaminanty. Nejprve jsme museli vyvinout techniku přenosu genetické informace pro produkci zymocinů a imunity vůči nim. Rozvinuli jsme metodu indukované fúze protoplastů, která dovoluje přenést virové partikule do hybridní buňky vzniklé fúzí, a doufali jsme, že to, co je ve virech, zajistí novému hostiteli jak produkci, tak imunitu. Za peníze získané od pivovarů jsme odstartovali kvasinkový výzkum, přidali k tomu jednak přednášky o kvasinkách včetně jejich průmyslového využití, jednak cvičení nutná k tomu, aby posluchači získali metodické zázemí pro experimenty.

Zásnuby pivovarské kvasinky se superzabijákem

Pro pivo-zabiják (paní profesorka proti tomuto drsnému pracovnímu názvu decentně protestovala, prý by mohl odradit zákazníky) jsme vybrali dva kvasinkové partnery: pivovarský kmen (S. cerevisiae var. carlsbergensis P9) ze smíchovského Staropramenu a kvasinku superzabijáka (S. cerevisiae T158C), která měla poškozený gen HIS3 potřebný pro syntézu histidinu.

Do média jsme přidávali histidin hotový. Zbývalo vyřešit otázku, jak oddělíme hybridy od původních rodičovských kmenů. Superzabiják, který nevyroste na médiu bez histidinu (zatímco hybrid ano), problémy nedělal. Jak ale odstranit kmen pivovarský? Rozhodli jsme se, že vyvineme novou selekční techniku založenou na imunitě k zymocinu K1, který produkuje superzabiják. Ověřili jsme si, že pivovarský kmen je k tomuto zymocinu citlivý, a předpokládali jsme, že hybrid citlivý nebude, protože ponese vlohy z kmene zabijáckého. Na médiu bez histidinu, ke kterému jsme přidali zymocin obsažený v bezbuněčném médiu po kultivaci superzabijáka, se opravdu vytvořily velké kolonie. Podstatnou část však představovaly kolonie cybridů (cy-toplazmatických hyb-ridů), které se od hybridů lišily tím, že obsahovaly jádro jen z pivovarského kmene, ale byly imunní vůči zymocinu a produkovaly jej. To se mohlo stát tak, že před fúzí buněk splynula spontánně jejich jádra a hybridní dikaryotická buňka se rozdělila. Jeden potomek byl cybrid s původním jádrem superzabijáka a cytoplazmou z obou rodičů (včetně částic podobných virům a jejich kódující dvojřetězcové RNA ze superzabijáka), druhý s pivovarským jádrem a opět cytoplazmou z obou rodičů. Ukázalo, že cybridy s pivovarským jádrem byly lepší než hybridy, a proto jsme nového pivovarského zabijáka hledali mezi nimi. V hybridech se totiž pekařské jádro chovalo nepřístojně, neboť obsahovalo gen POF udílející pivu podivnou ovocnou vůni, která by pivaře jistě pořádně naštvala.

Čmuchotesty

Musím přiznat něco, co jsme nikdy nepublikovali. Výběr mezi kmeny prováděla naše kolegyně Eva Koutecká, o které jsme věděli, že je hypersenzitivní na různé pachy. Vhodné cybridní kmeny nám doslova vyčmuchala, přesněji řečeno označila nezajímavé hybridy jako páchnoucí, takže šlo spíše o negativní čichovou selekci. My jsme pak jen dodatečně prověřili, že ty zbývající jsou opravdu cybridy, a podrobně jsme charakterizovali jejich další pivovarské vlastnosti. S nejnadějnějším kandidátem se šlo do provozních zkoušek, které se konaly ve Strakonicích. Předtím se však muselo ověřit, že zymocin savcům včetně člověka neškodí a opravdu je jak se předpokládalo specifickým prostředkem jen pro vyrovnávání účtů mezi kvasinkami.

Pan sládek

Dodnes nemohu zapomenout na ten svěží den. Strakonický pivovar seděl v oparu mlhy, kterou sem odvál svěží vítr od Otavy. Ptal jsem se po panu sládkovi. Hned přijde, zatím vám to tu ukážu, pravila oslovená a potutelně se usmála. Přiznám se, byl jsem nervózní. Naše mnohaměsíční práce tu čekala na rozhodnutí, které měl vyřknout zkušený sládek pan Oldřich Vlach. Prošli jsme pivovarem, prohlédli jsme si i sauny pro zaměstnance a mně se zdálo, že tu čas plyne krásně, ale na můj vkus příliš pomalu. Potom jsme se vrátili do hlavního traktu. Pan Vlach nás už čekal. Posaďte se, vybídl mě srdečně, hned vám přineseme vzorek. Průvodkyně zmizela a za chvíli se vrátila s plnou sklenicí. Mok byl zlatý a bohatě napěněný. Aspoň to, oddechl jsem si. Na tváři pana sládka se objevil opět ten potutelný úsměv. Tak to vaše dílo ochutnejte, pravil. Vy nebudete? zeptal jsem se. Já už jsem koštoval, odpověděl. Přiblížil jsem nos k nádobě a hned jsem cítil, že něco není v pořádku. První hlt a pohroma. Pan sládek se smál. Nedalo se to pít.

Tak to je konec, postavil jsem se k problému čelem. Copak vy vědátoři, vy jste hned se vším hotovi. Přineste nám, prosím, radši Nektar a my to tady zatím probereme, obrátil se pan Vlach na mou průvodkyni. Pak mi vysvětlil, že bych se v závěrech neměl unáhlovat: Ono se to zlepší, až si kvasinky zvyknou na vodu a ostatní věci. Přijeďte znovu asi za měsíc a uvidí se. Jasně si vzpomínám, že jsem jeho chlácholení nevěřil. Výroba piva je biochemický proces a ne nějaké čarování. Na katedře jsem to popsal jako katastrofu a pár dní mi nechutnalo jídlo. Jen paní profesorka, která věděla, jak to v pivovarech chodí, zůstala klidná. A měla pravdu. Jak pan sládek předpověděl, tak se stalo.

Kmen si ve Strakonicích zvykl, vyrobilo se pivo a bylo dobré, velmi podobné Staropramenu. I podle prověřených mistrů ochutnávačů prošlo se ctí. Potvrdili jsme, že série vybraných kvasinek rodu Saccharomyces přidaných do piva není v přítomnosti zymocinu schopná růst. Použití tohoto nového kmene nemohly narušit ani nejběžnější kvasinky produkující zymocin typu K1, což bylo také výhodné. (V anglických pivovarech prý mívali velké ztráty způsobené zavlečením smrtících kmenů mezi původní kvasinky.) Navíc nám v rukávu zůstala nová selekční technika vhodná pro vylepšování průmyslových kvasinek. V úvodní části projektu jsme vypracovali velmi citlivou metodu pro stanovení aktivity zymocinů, která byla založena na tom, že se zabité buňky vybarví rhodaminem B. Teď se nám hodila. V pivu před filtrací jsme zjistili velké množství zymocinu, který byl s to se vypořádat s masivní kvasinkovou kontaminací. Po filtraci se hladina zymocinu v lahvích snížila natolik, že nebyla běžnými metodami zachytitelná, naše rhodaminová fluorescenční barvička však zymocin prokázala i tam.

Stopy se větví

Jedna část naší skupiny pokračovala v konstrukci dalších kmenů pro pivovarský provoz, druhá se věnovala základnímu výzkumu inspirovanému prvním pivovarským projektem.

Pro výrobu nízkokalorického piva se sníženým obsahem dextrinů jsme se snažili opět pomocí indukované fúze protoplastů propojit vlastnosti pivovarského kmene s nositeli různých enzymových aktivit. Potřebovali jsme katalyzovat štěpení dextrinů tak, aby uvolněné zlomky kvasinky spotřebovaly a tím snížily obsah sacharidů v pivu. Jako zdroj genu pro glukomylázu, která štěpí dextriny, posloužil S. diastaticus, kmen, v němž byl odstraněn funkční gen POF. Pivovarským rodičem byl nakonec kmen S. cerevisiae var. carlsbergensis P95. Metodou fúze jsme dostali kmeny, které umožnily vyrobit nízkokalorické pivo, i když jejich další pivovarské vlastnosti, mimo jiné i růstová rychlost, nebyly nejlepší. Naštěstí se zlepšily pasážováním za podmínek simulujících provoz.

Druhá cesta vedla za poznáním mechanizmu účinku zymocinu K1. Prokázali jsme, že zymocin K1 dělá pravděpodobně póry do membrány aktivně rostoucích buněk, zatímco pomalu rostoucí nebo nerostoucí buňky citlivých kmenů nejsou usmrcovány. ²⁾ Póry se objevovaly po přidání zymocinu, přidání samotného média nemělo žádný vliv.

Inspirace

Světovou i československou obec kvasinkářů tyto výsledky velmi zajímaly, neboť fenomén zymocinů byl dosti dlouho na výsluní vědeckého zájmu. Naše experimenty, původně pro pivovary, zaujaly fyziky natolik, že se interakcí zymocinů a jiných látek s membránami zabývají dodnes. Využívají k tomu, podobně jako se to dělalo zpočátku, metodu fluorescenčních sond. Výběr sond se ovšem podstatně rozšířil a nesleduje se již pouze změna intenzity fluorescence, ale řada mnohem obtížněji dostupných parametrů.

Poznatky o vlastnostech zymocinů a o časných příčinách buněčné smrti nám umožnily vypracovat řadu zlepšených variant původní metody selekce hybridů, respektive cybridů, za účasti zymocinů, a navíc využít zymociny pro další selekční účely. ³⁾

Léčba zabijáctví a souvislosti

Buněčné dělení kvasinky je méně citlivé k teplotě než reprodukce dvojřetězcové RNA, resp. virových partikulí, takže se kultivací při teplotě okolo 40 °C mohou zymocinogenní buňky od zabijáctví vyléčit. Při konstrukci průmyslových kmenů lze použít zymocinovou selekci, a pokud není zymocinogenní charakter žádoucí, může nastoupit léčba. Po vyléčení lze znovu opakovat fúzi s nějakým zymocinogenním kmenem a selektovat hybridy se zvýšenou ploidií (počtem chromozomálních sad). Cyklus se může několikrát opakovat a tak řízeně zvyšovat ploidii vybraného rodiče.

Citlivé kvasinky zvyšují svou odolnost vůči zymocinu, když rostou pomaleji. Když nerostou, mohou být téměř zcela odolné. Pomocí zymocinu lze tudíž hromadit např. auxotrofní mutanty (chybí jim schopnost syntézy určitých látek). Např. his^- mutant neroste na médiu bez histidinu, ale také není za těchto podmínek usmrcen zymocinem, zatímco nemutované his+ buňky rostou a usmrceny jsou. Takto se daří nahromadit his mutanty.

Zymocin K1 kóduje cDNA kopie MdsRNA a lze ji použít jako selekční znak na vektorech pro genové inženýrství kvasinek. Transformované buňky vytvoří na podkladu citlivých buněk dvorce s kolonií transformovaného kmene uprostřed. Tak je lze rozeznat. Pokud se udělá za pomoci takového vektoru genomová knihovna, má soubor kmenů samočisticí schopnost. Když se z buňky ztratí rekombinantní DNA, okolní buňky, produkující zymocin, ji usmrtí, protože ztratila nejen schopnost produkovat zymocin, ale i imunitu. Takové kádrování udržuje čistotu souboru klonů v knihovně, neboť vektor s genem pro zymocin funguje jako legitimace značící příslušnost ke klanu zabijáků. Výstup z klanu se trestá smrtí, jako u mafiánů.

Pokud chceme k modifikaci použít kmen, který není zymocinogenní, můžeme do něj zavést jak schopnost produkce zymocinu, tak imunitu k němu hned několika způsoby. Prvním je fúze nebo sexuální hybridizace, druhým je transformace vektorem obsahujícím příslušnou cDNA. V současné době jsou k dispozici geny pro teplotně stabilní i nestabilní zymociny.

Naše poslední výsledky (z r. 2001) ukazují, že buňky jsou k zymocinu K1 a K2 nejvíce citlivé okolo zahájení S-fáze buněčného cyklu a nejméně před dělením. Tento poznatek by se dal využít k selektivnímu odstraňování buněk v určité fázi buněčného cyklu z kultury buněk. Výzva k praktickému využití tohoto poznatku však zatím nepřišla.