Niekto to rád horúce

Našej pozornosti unikajú výkony vedcov v rôznych odvetviach, ktorí len preto, že pociťujú potrebu rozšíriť naše poznanie, neváhajú pracovať v mimoriadnych podmienkach. Za všetkých spomeniem mladú mikrobiologičku, ktorá mi priblížila izoláciu baktérií z okrajov aktívnych vulkánov. V azbestovom obleku s plynovou maskou na tvári bola spúšťaná na miesto, kde sa teplota blížila k bodu varu vody a koncentrácia sirovodíka (veľmi aktívneho jedu) dosahovala úroveň ohrozujúcu život. Toto bola ochotná podstúpiť len preto, že chcela vyizolovať nový, zaujímavý druh mikroorganizmu. Tu by sme chceli začať našu exkurziu do sveta mikroorganizmov na miesta, kde (s trochou antropomorfizácie) niekto to rád horúce (pozri Vesmír 79, 253, 2000/5), niekto naopak chladné, kyslé, prípadne alkalické.

Život mikroorganizmov, aj keď mnohé z nich nachádzame v mimoriadne extrémnych podmienkach (prinajmenšom z ľudského pohľadu) nie je zaujímavý dokonca ani pre väčšinu profesionálnych biológov, pokiaľ nám nespôsobujú nejakú zdravotnú ujmu, prípadne ujmu na majetku, povedzme koróziu nosných stĺpikov oplotenia našej záhradky. Áno, aj na tomto sa môžu výrazne podielať niektoré pôdne mikroorganizmy.

Štúdium extrémofilov. V roku 1990 vznikol v rámci Tretieho rámcového programu EU Biotechnologický program, ktorý bol zameraný na podporu štúdia organizmov žijúcich v extrémnych podmienkach. Tento program sa sústredil hlavne na štúdium troch typov týchto extrémofilov. Sú to mikróby žijúce pri:

• extrémnych teplotách (termofily žijú pri teplotách 50-110 °C a psychrofily čiže chladnomilné pri teplotách 5-20 °C),
• extrémnych pH (acidofily žijú pri pH nižšom ako 2 a alkalofily pri pH vyššom ako 9),
• vysokých koncentráciách solí 3-25 % (halofily).

Tieto mikroorganizmy poskytujú mimoriadne cenný model pre pochopenie toho, ako sú biomolekuly stabilizované za extrémnych podmienok. Doterajšie výsledky jednoznačne ukázali, že extrémofily sú významným zdrojom katalyzátorov s priemyselným využitím.

Psychrofilné a termofilné mikroorganizmy. Najnižšia teplota, pri ktorej mikroorganizmy žijú, je mínus 12 °C, najvyššia 112 °C. V tomto teplotnom rozsahu dochádza k významným zmenám rýchlostí chemických reakcií, ako aj k dramatickým zmenám fyzikálnych vlastností biomolekúl. Možno je to ťažko uveriteľné, ale žijeme na pomerne chladnej planéte. Viac ako 80 % biosféry má permanentnú teplotu pod 5 °C. Tento fakt je daný hlavne tým, že približne 2/3 oceánskej vody vo veľkých hĺbkach má konštantnú teplotu okolo 2 °C. Aj tieto oblasti, napriek svojmu extrémnemu charakteru, boli kolonizované rôznymi mikroorganizmami, u ktorých sa vyvinuli špecifické adaptačné stratégie, umožňujúce prežívať v tomto nehostinnom prostredí. Skutočnosť, že väčšina chemických reakcií v bakteriálnej bunke je katalyzovaná špecifickými enzýmami, napovedá, že enzýmy psychrofilných mikroorganizmov sú tiež adaptované na chlad. Ukazuje sa, že zmeny tvaru (konformácie) psychrofilných enzýmov, ktoré sú nevyhnutné pre dosiahnutie aktívneho stavu enzýmu, sú energeticky menej náročné ako u mezofilných baktérií.

Pre prežitie v extrémne chladnom prostredí je dôležité aj zachovanie fluidity bunkovej membrány, ktorá je rozhodujúca pre transport látok dnu a von z bunky. Je známe, že zníženie teploty vedie k zvýšeniu rigidity bunkovej membrány, čo si mikroorganizmy kompenzujú desaturáciou mastných kyselín v membránach. (Pri desaturácii sa zvyšuje počet nenasýtených dvojitých väzieb, čo vedie ku stekucovaniu membrány.) Účelom teplotne závislých zmien v biomembránach je pravdepodobne udržanie permeability membrán na konštantnej úrovni.

Homeostáza protónovej permeability cytoplazmatickej membrány predstavuje u baktérií, ale i u skupiny Archea, jeden z kľúčových bioenergetických parametrov. Bakteriálna cytoplazmatická membrána sa stáva veľmi permeabilná pre protóny vtedy, keď je teplota okolia vyššia ako maximálna rastová teplota študovaného mikroorganizmu. To v konečnom dôsledku vedie k zastaveniu rastu baktérie pre neschopnosť tvoriť ATP a udržať membránový potenciál.

Ďalším zaujímavým javom, ktorý bol pri štúdiu chladomilných mikroorganizmov objavený, je produkcia proteínov s protimrznúcimi vlastnosťami. Tak napr. u baktérie Micrococcus cryophylus sa objavili proteíny, ktoré organizmy vylučujú do vonkajšieho prostredia a ktoré efektívne chránia baktérie proti poškodeniu počas mrznutia okolitej vody. Okrem týchto proteínov sa aj u mezofilných baktérií, napr. u E. coli objavili proteíny, ktoré umožňujú harmonický rast uvedených baktérií aj v chladnom prostredí (cold shock proteins). Štúdium týchto biologických mechanizmov je v čase narastania ceny energie obzvlášť aktuálne. Psychroenzýmy nepochybne pomôžu pri mnohých chemických procesoch šetriť energiu, umožnia, aby chemické reakcie zaujímavé z hľadiska biotechnológie prebiehali pri výrazne nižších teplotách, aké sa používajú doposiaľ.

Prejdime teraz do sveta z hľadiska života extrémne teplého. Práve tento svet, kde vládnu teploty okolo bodu varu vody, bol donedávna pokladaný za biologickú púšť. V posledných rokoch sa však predstava o biologickej púšti posunula do opačnej polohy dažďových pralesov, ktoré, ako je známe, hýria pestrosťou najrôznejších foriem života.

Extrémne teplé prostredie, ktoré je prijateľné pre život baktérií, sa prekvapujúco objavilo vo vulkanických oblastiach ako nad hladinou, tak aj pod hladinou mora. Už v šesťdesiatych rokoch mikrobiologické výskumy v Yellowstonskom parku priniesli neuveriteľné objavy. Z horúcich prameňov sa podarilo vyizolovať baktérie, ktoré rástli pri teplote bodu varu vody. Tieto zistenia odporovali všetkým ustáleným predstavám biochemikov o stabilite proteínov, ktoré by pri takýchto teplotách mali byť kompletne zdenaturované. Iným zaujímavým miestom výskytu mikroorganizmov sú hlbokomorské hydrotermálne vulkány (pramene), (viď Vesmír 79, 323, 2000/6). Boli nájdené napríklad v Tichom oceáne v hĺbke okolo 2600 m a ich výskum bol umožnený len vďaka špeciálnym batiskafom. Vyviera z nich tekutina, ktorej teplota sa pohybuje okolo 360 °C, je anoxická a obsahuje okrem iných solí aj vysokú koncentráciu sulfanu. Práve odtiaľ sa podarilo vyizolovať mikroorganizmy, ktoré rastú až pri teplote okolo 100 °C, napr. Pyrococcus furiosus. Čo sa vlastne deje s ich proteínmi a cytoplazmatickou membránou, že dokážu tolerovať takéto teploty? Aké fyzikálne a chemické vlastnosti musia mať termoenzýmy, aby tieto drastické podmienky boli pre ne znesiteľné? Doposiaľ na tieto otázky niet jednoznačných odpovedí. Ukazuje sa ale, že špecifické molekulové mechanizmy, ktoré vysvetľujú termofilicitu a termostabilitu, sú rôzne od enzýmu k enzýmu. Medzi tieto mechanizmy patria všetky tie, ktoré pozorujeme aj u mezofilných enzýmov (hydrofóbne interakcie, soľné mostíky, vodíkové väzby a pod.). Teda nič zázračné, ale len špecifické využitie známych fyzikálno-chemických princípov.

Biologické membrány sú okrem iného zložené z lipidických molekúl, ktorých polárne časti sú orientované do vodnej fázy, zatiaľ čo hydrofóbne časti sú orientované do vnútra membrány. Keď organizmy rastú pri optimálnej teplote, membránové lipidy sú v polotekutom stave, ktorý vytvára optimálnu matrix pre transportné a iné membránové proteíny. Zároveň biologická membrána vytvára bariéru voči molekulám, ktoré sa vyskytujú vo vonkajšom prostredí. Zvyšovanie a znižovanie teploty vedie k zmenám priepustnosti membrány voči rôznym látkam a iónom, čo by mohlo narušiť vnútorné prostredie bunky. Z týchto dôvodov majú mnohé mikroorganizmy vyvinuté ochranné systémy. Pri zmenách optimálnej rastovej teploty sú schopné adaptačného chovania, ktoré je založené na zmenách zloženia lipidických molekúl membrán. Takéto chovanie im umožňuje udržovať správnu viskozitu membrány, čo je nevyhnutný predpoklad pre ich život. Pri zvýšenej teplote sa obyčajne predlžuje acylový reťazec membránových lipidov, prípadne stupeň ich nasýtenosti. U archeí zvýšenie teploty vedie k cyklizácii mastných kyselín a špecifickému prechodu diéterov na tetraétery. (Membrány skupiny Archea vo svojej štruktúre nemajú mastné kyseliny naviazané na molekulu glycerolu esterickou, ale éterickou väzbou.) Na zníženie rastovej teploty reagujú naopak desaturáciou lipidického reťazca.

Acidofilné a alkalofilné mikroorganizmy. Koncentrácia protónov v prírodnom prostredí varíruje od kyslého až po alkalické pH. Hodnota pH riek a jazier sa väčšinou pohybuje od 6,0 do 8,0. V tom istom rozmedzí sa pohybuje aj pH normálnej pôdy, pH oceánov je posunuté do alkalickejšej oblasti od 7,5 do 8,4. Niektoré vodné prostredia majú ale extrémne kyslé alebo alkalické pH a napriek tomu aj v týchto prostrediach môže mikrobiálny život prekvitať. Prečo je hodnota pH pre mikrobiológov zaujímavá? pH má totiž vitálnu dôležitosť pri disociácii elektrolytov a rozpustnosti niektorých plynov vo vode (CO₂, NH₃ a pod.), čím výrazne ovplyvňuje schopnosť mikroorganizmov rásť v danom prostredí. Vráťme sa ale späť k našim extrémom. V geotermálnych jazerách, horúcich gejzíroch, vo vulkanickej pôde obsahujúcej síru je opäť život mikroorganizmov paradoxne čulý. Kyslé pH je v tomto prostredí vytvárané geotermálnymi procesmi. Vulkanická síra je oxidovaná až na kyselinu sírovú. V týchto prostrediach sa našli mikroorganizmy, ktoré prežívajú aj pri pH menšom ako 0.

Len málo prirodzených prostredí na Zemi je takých, kde pH je vysoké. Spomeňme aspoň jazerá, v ktorých je hlavným zdrojom alkalinity uhličitan sodný (Na₂CO₃), či záchody, kde sa rozkladá močovina a pod. Hodnota pH v miestach, kde žijú alkalofily, môže dosahovať až 10,5. Medzi modrozelenými riasami, ktoré patria vo všeobecnosti medzi alkalofily, bol nájdený najalkalofilnejší mikroorganizmus Plectonema nostocorum, ktorý rastie dokonca pri pH 13. V tejto súvislosti sa vynára niekoľko závažných otázok. Ako acidofily a alkalofily udržujú vnútrobunkové pH, ktoré sa nie veľmi líši od neutrálneho? Ako sú uspôsobené membrány a membránové proteíny voči týmto extrémom? Ani mechanizmus tolerancie acidity a alkalinity nie je doposiaľ uspokojivo vyriešený. Predsa sa ale u týchto extrémofilov ukazuje spoločný menovateľ. V extrémnych podmienkach nachádzame prevažne Archaea, ktorých cytoplazmatická membrána obsahuje unikátne éterové lipidy. Tie nie sú ľahko degradovateľné, sú teplotne a mechanicky rezistentné a znášajú aj vysoké koncentrácie solí. Čo je však dôležité z hľadiska tvorby energie u týchto mikroorganizmov: mnohé z nich majú tetraéterové lipidy (termofily a extrémne acidofily), ktorých usporiadanie v membráne spôsobuje nepriestupnosť takýchto membrán voči protónom. U týchto mikroorganizmov prišlo k molekulárnej adaptácii, ktorej princípy poznáme len čiastočne.

Halofilné mikroorganizmy. Podstatne menej pozornosti ako štúdiu termofilov sa venovalo halofilom. Ich biotechnologický potenciál bol pomerne dlho ignorovaný. Je totiž známe, že tieto mikroorganizmy boli v spojení s najstaršími ľudskými priemyselnými aktivitami. Už 2500 rokov pred Kristom bola pozorovaná červená pigmentácia soľných jazier pri výrobe soli. Záujem o halofily bol podnietený ich nežiadúcim rastom na potravinách konzervovaných soľou, hlavne rybách. Keď boli ryby skladované v teplých a vlhkých podmienkach v prítomnosti soli, príležitostne dochádzalo k ich zružoveniu. Toto sfarbenie bolo spôsobené rastom halobaktérií, hlavne z rodov Halobacterium a Halococcus. Vzhľadom k tomu, že ide o aktívne proteolytické organizmy, dochádzalo často k značnému rozkladu rybacieho mäsa. Na druhej strane sa využívajú aj pozitívne vlastnosti týchto mikroorganizmov. Halofilné a halotolerantné baktérie sú dlho využívané pri produkcii rôznych poživatín. Spomeňme napr. thajskú rybaciu omáčku, sójovú omáčku alebo japonské miso. Niektoré halofily sa využívajú pri hľadaní protirakovinových látok. Nedávno sa zistilo, že tvoria polyméry, ktoré sú zaujímavé z hľadiska technológie termoplastov a pod.

Podmienky, pri ktorých halofily rastú, sú prinajmenšom nevšedné. Nachádzame ich vo veľkých množstvách v nasýtených roztokoch chloridu sodného (NaCl) ako exkluzívnych obyvateľov. Halobaktérie sú tiež nepochybne organizmy, ktoré obsahujú najvyššiu koncentráciu anorganických iónov v cytoplazme. Keď rastú za optimálnych podmienok, koncentrácia NaCl dosahuje až 5 mólov na liter. To ale znamená, že celá vnútorná mašinéria halofilov pracuje v podmienkach extrémnej iónovej sily, a preto ich bielkoviny, ale i membrány musia byť na takéto mimoriadne podmienky nastavené. Aj v tomto prípade sa ukazuje, že ich bielkoviny sú halofilné, t.j. že sú stabilné len v prítomnosti extrémnych koncentrácií solí. Štúdium halofilných proteínov preukázalo, že obsahujú neobvykle veľké množstvo kyslých aminokyselín a nízke množstvo bázických aminokyselín. Takéto aminokyselinové zloženie proteínov pravdepodobne umožňuje adekvátnu vyrovnanosť hydrofóbno-elektrostatických interakcií ako aj adekvátnu hydratáciu. V extrémne slaných prostrediach sa vyskytujú hlavne Archaea. Zloženie ich membrán je podobné ako u ostatných extrémofilov (ako to už bolo spomenuté vyššie), čo pravdepodobne spoluvytvára optimálne predpoklady prežitia v prítomosti priam neuveriteľných koncentrácií anorganických solí.

Možnosť využitia v priemyslovej biokatalýze

Mnohé získané experimentálne výsledky dotýkajúce sa extrémofilov často významne menia naše učebnicové predstavy o živote vo všeobecnosti. Na druhej strane sa ukazuje, že poznávanie enzýmových systémov extrémofilov otvára novú éru v biotechnológii. Každá skupina spomínaných mikroorganizmov má unikátne vlastnosti. Mnohé enzýmy izolované z týchto organizmov sú za extrémnych podmienok výrazne stabilnejšie ako bežné enzýmy. Z tohto dôvodu ich využitie v priemyslovej biokatalýze vedie, a hlavne v budúcnosti povedie k prepojeniu medzi biologickými a chemickými procesmi, pretože mnohé chemické procesy častokrát prebiehajú tiež za extrémnych podmienok pri vysokých teplotách, vysokých tlakoch, extrémnom pH a podobne, čo predstavuje vysoké prevádzkové náklady.