Renaturace a hybridizace DNA

V myslích vědců, kteří se tak či onak zabývali výzkumem genetického materiálu, je Marmurovo jméno spojeno zejména s metodou izolace DNA z bakterií, kterou navrhl začátkem 60. let a která se v různých variantách používá dodnes. Tato jeho práce byla citována jinými vědci více než 6 700krát (údaj z r. 1991), metoda byla však využita vícekrát, aniž by byl citován původní autor. Tato významná metodická práce byla, zřejmě úmyslně, publikována s určitým zpožděním; proto mohla být tak důkladně propracována a opatřena řadou poznámek, svědčících o autorových zkušenostech s metodou. Vyřešení otázky izolace bakteriálních DNA (v nativní formě) bylo důležitým předstupněm nejvýznamnějšího Marmurova objevu, který učinil koncem 50. let během svého působení na Harvardově univerzitě. Spolu s Paulem Dotym zjistili, že dva řetězce dvoušroubovicové molekuly DNA mohou být od sebe odděleny a za určitých podmínek opět spojeny. Při tomto znovuspojení řetězců se vytvoří dvojitá šroubovice DNA, která má fyzikální, chemické a biologické vlastnosti původní (nativní) DNA. Tento děj nazvali autoři „renaturace“, na rozdíl od denaturace, při které je dvoušroubovicová struktura porušena a řetězce se od sebe oddělují. Další práce J. Marmura a jeho spolupracovníků ukázala, že směsi normální a hustotně značené jednořetězcové (denaturované) DNA mohou vytvářet hybridní dvoušroubovicové molekuly a že k hybridizaci dochází mezi řetězci DNA příbuzných bakteriofágů a bakterií.

Objev renaturace potvrdil dvouřetězcový charakter molekuly DNA i její funkci nositelky dědičné informace a otevřel nové cesty rozvoje molekulární biologie a genetiky. Ve své době vzbudil sice značný zájem, jeho význam však nebyl doceněn. Málokdo z dnešních molekulárních biologů si pravděpodobně uvědomuje, že objev renaturace DNA, učiněný více než před 35 lety, patří k základním principům uplatněným při vývoji technologií rekombinantní DNA, zjišťování pořadí nukleotidů (DNA sekvenace) a při amplifikaci DNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR), včetně hybridizačních testů DNA využívaných v klinické diagnostice, soudním lékařství, archeologii atd. Spoluobjevitel dvoušroubovicové struktury DNA, nositel Nobelovy ceny z r. 1962 James D. Watson, v minulém roce napsal: „Nyní bereme hybridizaci DNA jako samozřejmost, neboť tvoří základ technologií rekombinantní DNA. V době svého objevu, v padesátých letech, byla renaturace DNA (alespoň pro mne) jevem zcela neočekávaným.“

S J. Marmurem jsem se poprvé setkal v červnu roku 1961 na letišti v Praze. V ruce jsem držel výtisk časopisu Biochemica Biophysica Acta jako poznávací znamení a čekal důstojného, šedivějícího vědce středních let. Byl jsem překvapen, když ke mně přistoupil černovlasý muž jen o málo starší než já. Proč došlo k tomuto setkání? Roku 1960 jsem publikoval v časopise Nature práci o elektroaktivitě DNA, která nasvědčovala tomu, že oscilografická polarografie (dnes bychom řekli chronopotenciometrie) by mohla být vhodná ke sledování denaturace i renaturace DNA. V témže roce jsem od J. Marmura dostal dopis s nabídkou možnosti spolupráce. Tento dopis vyvolal velké nadšení u mne, nikoliv však u vedení ústavu, neboť v té době u nás nebylo zvykem, aby mladým nestraníkům byla povolována cesta na Západ. Moje odpověď J. Marmurovi musela být tedy „neslaná nemastná“. Kupodivu jej tato odpověď neodradila a tak se mezi námi rozvinula korespondence, která vyústila v návrh, že by se J. Marmur zastavil v Brně při své cestě na Světový biochemický kongres v Moskvě (srpen 1961). Během jeho návštěvy v Biofyzikálním ústavu jsem mu demonstroval oscilopolarografická měření denaturace a renaturace DNA, která vzbudila jeho další zájem. Jeho rozhovor s ředitelem ústavu F. Herčíkem způsobil, že moje cesta do USA přestala být považována za zcela neuskutečnitelnou.

Trvalo to ještě asi rok a půl, ale nakonec mi bylo povoleno do USA odjet. J. Marmur mezitím změnil působiště; z Harvardu přešel na nedalekou Brandeisovu univerzitu, kde šéfem oddělení biochemie byl známý enzymolog N. O. Kaplan. Do Bostonu jsem přijel s doporučením nositele Nobelovy ceny J. Heyrovského v kapse a s čerstvými výsledky, které jsem získal po odjezdu J. Marmura z Brna. Tyto výsledky ukazovaly, že denaturaci DNA předcházejí strukturní změny, které se svým charakterem liší od změn denaturačních. J. Marmur byl tímto výsledkem překvapen a přál si, abych u něj v laboratoři výsledky zopakoval s jeho vzorky DNA. Před svým odjezdem z Československa jsem svůj oscilopolarograf odeslal letecky do USA. (Oscilografický polarograf se v té době vyráběl pouze v Československu. Metodu oscilografické polarografie vnuceným střídavým proudem navrhl Jaroslav Heyrovský.) Představoval jsem si, že přístroj na mne bude už v laboratoři čekat. Nebylo tomu tak. Vzhledem k tomu, že můj kufr, který se mi cestou do USA ztratil, přišel s třídenním zpožděním, předpokládal jsem, že za několik dní dostanu i přístroj. Můj předpoklad byl však chybný. Trvalo mu to více než půl roku a přišel v dezolátním stavu – pro měření zcela nepoužitelný. Brzy po svém příjezdu jsem se tedy z dlouho očekávaného experta proměnil v učně.

Postdoktorandi i studenti (v naší terminologii aspiranti nebo doktorandi) říkali J. Marmurovi „Julius“. Mimo laboratoř byl Julius velmi přátelský a společenský, v laboratoři racionální, pracovitý a nesmlouvavý šéf. Jeho autorita neplynula jen z jeho profesury, ale především z jeho znalostí, výtečných nápadů a schopnosti vysvětlovat složité věci jednoduchým způsobem. Pod Juliovým vedením jsem se zapojil do práce v laboratořích a naučil se řadu nových metod. Pracovali jsme s bakteriofágy B. subtilus, centrifugovali jejich DNA v hustotním gradientu, separovali „lehké“ a „těžké“ řetězce, prováděli hybridizace a bakteriální transformace. Zjistili jsme, že pouze jeden ze dvou komplementárních řetězců DNA bakteriofága SP8 slouží jako matrice při syntéze specifické (mediátorové) RNA. Nebyly to jenom experimentální metody, které jsem se od Julia naučil, poznal jsem také, jak se dělá věda.

Dodnes lituji, že jsem svůj přístroj nedostal v pořádku hned po svém příjezdu. Podařilo se nám jej sice opravit ke konci mého pobytu (s pomocí jednoho opraváře televizorů, který ještě pamatoval rádia s elektronkami, na rozdíl od mladých inženýrů ve fakultní dílně) a provést na něm určitá měření, ale to už měl Julius sbaleno a stěhoval se do New York City, kde pracovala jeho žena Mildred (pozdější místoředitelka vydavatelství Random House a samostatná vydavatelka), která do Bostonu nechtěla, protože tam nemohla najít tak dobrou práci jako v New Yorku. A tak jsem svá měření, která jsem tolik chtěl předvést Juliovi, dělal u prof. Larryho Grossmana, jenž mi na zbývající čas poskytl místo v laboratoři.

Jsem přesvědčen, že kdyby Marmurova laboratoř použila elektrochemickou metodu k analýze DNA r. 1963, stala by se tato metoda rychle běžným nástrojem studia DNA. K tomuto přesvědčení mě vedou nejméně dva důvody: a) Vím, že tato metoda poskytovala informaci o vlastnostech a strukturních změnách DNA, které byly v té době aktuální, a byla přitom levnější a rychlejší než běžně používané metody. b) R. 1963 byl Julius Marmur zářící hvězdou a mnohé laboratoře se všemožně snažily být co nejblíž tomu, co dělal on. Pocítil jsem to na vědeckých konferencích, kde za mnou chodili lidé, kteří, často se špatně skrývanou závistí, se snažili dozvědět podrobnosti o dosud nepublikovaných výsledcích. Ti by po elektrochemii DNA přímo skočili. Uvažovat o „kdyby“ v historii je asi zbytečné. Nic takového se nemohlo stát. Začátkem šedesátých let byla „železná opona“ ještě příliš nepropustná – pro lidi, myšlenky, a dokonce i pro jednoduché přístroje z Československa.

Nedávno jsme spolu s J. Wangem z Nového Mexika použili chronopotenciometrii (v novém moderním hávu) k navržení biosenzoru pro hybridizace DNA, který by se mohl stát, po dalším rozpracování, jednoduchým zařízením schopným rozpoznat bodové mutace v DNA rychleji a levněji než dosavadní metody. Těšil jsem se, že Juliovi o tom povím, až přijede do Prahy převzít Mendelovu medaili. S bolestí a hořkostí si dnes uvědomuji, že už jej nikdy neuvidím. Prof. J. Marmur zemřel v pondělí 20. května t.r. v J. D. Weiler Hospital of the Albert Einstein College of Medicine v Bronxu. Na této fakultě byl profesorem biochemie a molekulární genetiky od mého odchodu v r. 1963.