O šíření signálů v živých organizmech

/pokračování z předchozího čísla/

A nyní k příběhu, který jsme nakousli a opustili v okamžiku, kdy Fatt s Katzem poprvé naměřili miniaturní synaptické potenciály, Robertson a někteří další objevili synaptické váčky neboli vezikuly a del Castillo opět s Katzem formulovali svoji krásnou, svůdnou a slavnou vezikulární teorii, kterou dnes najdete snad ve všech učebnicích fyziologie a kterou musí mít v malíčku každý student mediciny nebo biologie po druhém roce studia. Přitom nad ní již několik desítek let leží mrak nejistoty...

Závod o prvenství odstartován

Když del Castillo s Katzem svoji teorii publikovali, vzbudila zájem a obdiv fyziologů po celém světě a bylo hodně těch, kteří se ji okamžitě pokusili experimentálně potvrdit. Jedním z prvních byl V. P. Whittaker, který tehdy pracoval v Institute of Animal Physiology v Babrahamu v Anglii. Roku 1964 se jemu a jeho spolupracovníkům podařilo izolovat z mozkové tkáně výtažek s téměř čistými synaptickými vezikulami (v zájmu objektivity je třeba uvést, že totéž se podařilo již r. 1961argentinskému vědci I. de Robertisovi). Brzy nato zjistili, že tento preparát obsahuje značné množství acetylcholinu. Whittaker a jeho kolegové zajásali: vezikuly obsahují acetylcholin, první krůček k prokázání platnosti vezikulární teorie je tedy učiněn. Tehdy s nimi jásal i mladý Whittakerův žák, Francouz Maurice Israël.

Brzy poté se Whittaker přestěhoval nejprve do Cambridge a později do Ústavu biofyzikální chemie Institutu Maxe Plancka v Göttingenu, kde už zůstal. Tam už ho Maurice Israël nedoprovázel. Rozhodl se, že se pokusí být prvním, kdo přinese důkaz o platnosti vezikulární teorie. Odjel proto do Paříže, kde v Hopital de la Salpetriere založil vlastní laboratoř.

Israël věděl, že izolace cholinergických vezikul z mozkové tkáně je složitá záležitost, neboť v mozku je cholinergická jen malá část synapsí. Uvědomil si, že nejlepším východiskem by bylo pracovat s tkání, kde jsou cholinergické všechny synapse. A proto zapojil svoji skupinu do vývoje metody na izolaci synaptických vezikul z rejnoka. Roku 1968 se dostavil první výsledek a Jean Gautron, Bernard Lesbats a Maurice Israël získali z rejnokova elektrického orgánu preparát s čistými a ničím nekontaminovanými vezikulami. Stanovili v nich obsah acetylcholinu a zjistili, že je mnohonásobně vyšší než ve vezikulách získaných Whittakerem. Israëlova skupina tím Whittakera nepředběhla, avšak získala bohatý cholinergický materiál, který jí umožnil postupovat daleko rychleji.

Israëlovi a jeho spolupracovníkům, výborným biochemikům, však chyběl elektrofyziolog. Roku 1969 se Israël na konferenci ve Vareně seznámil s Y. Dunantem, který se tudy vracel do Ženevy z Cambridge, kde po určitou dobu pracoval právě jako elektrofyziolog. Oba se jakožto přesvědčení zastánci Katzovy vezikulární teorie rychle dohodli na spolupráci. Dunantův nový ženevský šéf, prof. R. W. Straub, bývalý žák Hodgkinův a Huxleyův (viz 1. část), dal Dunantovi zelenou. V letech 1969 až 1971 trávil Dunant každoročně několik měsíců v Paříži a zároveň budoval vlastní laboratoř v Ženevě. Když pak r. 1970 získal sir Bernard Katz Nobelovu cenu, nabyla soutěž mezi Whittakerem, Israëlem a Dunantem na intenzitě.

První pochybnosti

Začátkem sedmdesátých let vyvinul Dunant s kolegy přístroj, který umožnil okamžité zmrazení malých částí elektrického orgánu během dráždění nebo těsně po něm. Ve zmrazených vzorcích pak stanovili hladinu acetylcholinu ve vezikulách, ale také acetylcholinu v nervovém zakončení vně vezikul. Ten nazvali volný acetylcholin. Do těchto pokusů vkládala Dunantova i Israëlova skupina velké naděje. O to větší je čekalo zklamání. Pokusy v ženevské laboratoři se opakovaly po dlouhé týdny, objednávky rejnoků z Arcachonu se stále zvyšovaly, acetylcholin se stanovoval s největší možnou pečlivostí, ale výsledky byly stále stejné: vezikulární acetylcholin zůstával během dráždění beze změny. Místo toho se významně snižovala hladina acetylcholinu volného, extravezikulárního. Dunant s Israëlem se nenechali odradit. Napadlo je totiž vysvětlení: Kdyby každá vezikula v okamžiku, kdy svůj acetylcholin uvolní do synaptické štěrbiny, svůj obsah okamžitě doplnila z acetylcholinu extravezikulárního, pak by se během dráždění snižovala pouze hladina acetylcholinu volného, i když by se do synaptické štěrbiny vyléval acetylcholin uvolněný z vezikul. Dunant s Israëlem si uvědomili, že toto je jediné vysvětlení, které může vezikulární teorii zachránit. Jak to však prokázat?

V té době byl metabolizmus acetylcholinu již dobře znám. Nemalou měrou se o to zasloužili i pracovníci Fyziologického ústavu bývalé ČSAV, zejména skupina vedená S. Tučkem, z jehož knihy „Acetylcholine Synthesis in Neurones“ čerpali vědomosti fyziologové po celém světě. Zásadní otázkou pro Dunanta a Israëla bylo zjistit, zda se acetylcholin před svým vyplavením přesouvá do vezikul, nebo je vyplavován rovnou z extravezikulárního prostoru. Kdyby se ukázalo, že pravdivé je tvrzení první, byla by vezikulární teorie zachráněna. Výše uvedený problém se rozhodli řešit tak, že do fyziologického roztoku, ve kterém se elektrické orgány během pokusů nacházely, přidali stopové množství radioaktivního acetátu (nebo cholinu), a pak sledovali radioaktivitu acetylcholinu před drážděním, během dráždění a po něm. Kdyby acetylcholin během dráždění prošel vezikulami, nutně by se to muselo v radioaktivitě vezikul projevit, avšak nestalo se tak. Během dráždění se měnila radioaktivita frakce extravezikulární, ale uvnitř vezikul se nedělo naprosto nic. Tehdy se v hlavách obou přátel zrodila kacířská otázka: Uvolňuje se acetylcholin skutečně z vezikul? Pokusy pokračovaly, nejistota vzrůstala.

Začátek nových sporů

Whittaker v té době nezahálel. Zdálo se mu však, že vezikulární teorie je tak dokonalá, že ji není třeba dokazovat, a tak se on a jeho skupina zajímali hlavně o vlastnosti vezikul. Zjistili, že vezikuly kromě acetylcholinu obsahují též vysokou koncentraci kyseliny adenosintrifosforečné (ATP), kterou buňky využívají jako zdroj metabolické energie. Stanovili též obsah některých iontů ve vezikulách, zejména draslíku, sodíku, vápníku a hořčíku, studovali a charakterizovali řadu membránových transportních mechanizmů, hlavně těch, které mají vztah k uskladňování acetylcholinu ve vezikulách. A jejich výsledky byly zatím s vezikulární teorií v dokonalém souladu. Whittaker své výsledky s úspěchem uveřejňoval v renomovaných časopisech a vezikulární teorie vstoupila do podvědomí odborných kruhů jako neoddiskutovatelá samozřejmost.

V té době byli Dunant s Israëlem v daleko těžší situaci, neboť jen málokterý odborný časopis je ochoten uveřejnit práci, která je v naprostém rozporu s oficiální teorií. Proto se snažili prosadit na kongresech a konferencích. První Israëlovo vystoupení bylo přijato s nedůvěrou. Na dalším kongresu to bylo ještě horší. Whittaker Israëla přerušoval kritickými a posměšnými poznámkami.

Podobné šarvátky se pak opakovaly často a všichni účastníci na ně vzpomínají s humorem i nostalgií. Určitý zlom nastal r. 1972 na kongresu v Paříži, kdy se o slovo přihlásil sám sir B. Katz, tedy osobnost nejpovolanější. Jeho vystoupení bylo krátké a překvapující. Nesnažil se svou vezikulární teorii obhajovat, vyjádřil dokonce překvapení nad tím, že někdo mohl z jeho článků vyvodit tak kategorické závěry. Měl tehdy pravdu, nebo se jen snažil uklidnit rozvášněné diskutéry? Připomeňme si část citace u jeho práce: „Je možno si představit, že takové partikule by mohly ... uvolnit celý svůj obsah acetylcholinu.“ V jeho dalších pracích z té doby toho o vezikulární teorii mnoho nenajdeme (viz 2. část). Jedinou zmínku nalezneme ve sborníku konference konané r. 1955 v Gif-sur Yvette. Ke konci přednášky se Katz velice stručně zmínil o tom, že by acetylcholin vyplavený do synaptické štěrbiny mohl pocházet z vezikul, ale přednášku zakončil takto: „Spekulace tohoto druhu budou pravděpodobně mít krátký život, a snad není přehnané domnívat se ...že naše nynější představy budou brzy modifikovány nebo zavrženy.“ ¹⁾

Nebudeme se probírat všemi dalšími články, bude jednodušší, prolistujeme-li knížku, kterou Katz vydal o 14 let později ²⁾ , v době, kdy už měl na věc ustálený názor. Je útlá, srozumitelně napsaná a výraz synaptické vezikuly se v ní vyskytuje na sedmi místech. Nejprve v úvodu při popisu fotografie nervového zakončení pořízené elektronovým mikroskopem, pak v odstavci nadepsaném „naše pracovní hypotéza“ (obr. obrázek). Zde je vezikulární teorie popsána asi nejjasněji, ovšem opět jako hypotéza. Dále se Katz o vezikulách zmiňuje ještě na čtyřech místech, jednou uvažuje, zda by se do jedné vezikuly „vešlo“ dostatečné množství acetylcholinu, a dochází k závěru, že asi ano. Jinde spekuluje, zda je možné si představit, že by výlev acetylcholinu z vezikul byl závislý na vápníku. I tam dochází k názoru, že možné to je. Nikde netvrdí, že navrhovaný mechanizmus výlevu acetylcholinu je tím pravým. Není sporu o tom, že vezikulární teorii opravdu jako první formuloval Katz. Velkou reklamu jí však nikdy a nikde nedělal, o tu se postarali jiní.

Co tedy, když ne vezikuly?

Po Katzově vystoupení na pařížské konferenci Dunant a Israël konečně přišli na to, že věnovat většinu času k získávání argumentů použitelných proti svým protivníkům je plýtvání energií. Hlavně si ale uvědomili, že proti vezikulární teorii nemohou navrhnout teorii náhradní. Proto od té chvíle byla jejich práce zaměřena především na vytvoření vlastní hypotézy. Bylo jim jasné, že nejsou-li za kvantový výlev acetylcholinu zodpovědné vezikuly, musí se kvanta acetylcholinu uvolňovat nějakým důmyslným mechanizmem, umístěným v presynaptické membráně. Po mnohaletém úsilí z ní Israëlova skupina izolovala tajemný protein, který nazvali mediátofor. Tento protein pak inkorporovali do malých částeček umělých membrán, které mohou samovolně vytvářet jakási pouzdérka – proteolipozomy. V nich zůstane uzavřeno vše, co bylo v roztoku v okamžiku jejich vytvoření. Israël s kolegy si takto připravili proteolipozomy. Napřed do jejich membrán vpravili mediátofor. Uvnitř proteolipozomů se nacházel acetylcholin, ale ne vezikuly. Kdo četl pozorně až sem, jistě již tuší, kam Israël mířil. Jeho rozhodnutí orientovat svůj výzkum tímto směrem bylo riskantní, neboť nikdo nemohl vědět předem, zda tato zdlouhavá práce povede k úspěchu. Nyní se konečně mělo potvrdit, byla-li jeho intuice správná.

Vraťme se nyní časově o trochu zpět na Institut Maxe Plancka v Göttingenu. Tam ve své pracovně četl W. P. Whittaker Israëlovy a Dunantovy práce. A ačkoliv se tvářil, že nestojí ani za zlámanou grešli, četl je pozorně do poslední řádky. Stále doufal v platnost vezikulární teorie, ale výsledky přicházející z Gif-sur-Yvette a ze Ženevy ho zneklidňovaly. Tím spíš, že chování vezikul v jeho vlastní laboratoři nebylo zrovna v souladu s jeho představami. I jemu začalo být jasné, že s vezikulární teorií musí být něco v nepořádku. Začal psát svoji knihu ³⁾ (vyšla pak až r. 1992), pokračoval v pokusech, rozvíjel nové metody, shromažďoval výsledky a koncem sedmdesátých let dospěl k názoru, že není vezikula jako vezikula. Všechny sice obsahují acetylcholin, ale jen několik málo je schopno ho uvolňovat do synaptické štěrbiny. Ty ostatní fungují pouze jako rezerva. Teorie je to užitečná, protože dává za pravdu všem. Acetylcholin je vyplavován z vezikul, a i když ne ze všech, přece jen měl Whittaker v podstatě pravdu. Zároveň však měli trochu pravdu i odpůrci vezikulární teorie, neboť velká část vezikulárního acetylcholinu skutečně zůstává ve vezikulách rezervních, které jsou k dráždění netečné.

Whittaker své nové objevy uveřejnil r. 1978 a doufal, že tím konečně dozní dlouholetý spor. Jak mnoho se mýlil, zjistil ještě téhož roku v Čechách, na zámku v Žinkovech. Tam se konala konference, jejímž organizátorem byl již zmíněný S. Tuček. Israël s Dunantem informovali o dvou svých pracích a výsledky shrnuli do celkem jednoduchého modelu nervového zakončení ⁴⁾ , viz obr. obrázek. Whittaker s Zimmermanem a dalšími kolegy předložili podstatně složitější model (obr. obrázek). Na stejném zasedání přednesl svoji práci všestranně nadaný František Vyskočil, vynikající neurofyziolog, který byl též jedním z aktérů této zamotané historie. Diskuse během přednášek i po nich byla opět na ostří nože a Whittaker zjistil, že válečná sekera zakopána nebyla. Dunant s Israëlem byli tehdy již skálopevně přesvědčeni, že za kvantový výlev acetylcholinu nejsou zodpovědné vezikuly, ale nějaký mechanizmus nacházející se v presynaptické membráně. V květnu 1979 uveřejnili článek ⁵⁾ pod názvem „Když vezikulární teorie již není dále vezikulární teorií“, z něhož citujeme: „Aby se Whittaker a Zimmerman mohli udržet v rámci vezikulární teorie, byli nuceni vymyslet si novou terminologii. Nyní, kdy pravé synaptické vezikuly tvrdošíjně odmítají dokázat vezikulární hypotézu, bylo jméno vezikuly dáno jakési těžší membránové frakci.“ Whittaker byl na nejvyšší míru rozladěn. Přispělo k tomu i to, že Dunant s Israëlem v té době přestali být osamělými střelci. Vezikulární teorii začali kritizovat i jiní, mezi nimi zejména Roger Marchbanks a Ladislav Tauc. Whittaker se o nich v dalším článku vyjádřil velice neuctivě, říkal jim „čtyřčlenná banda“. Ve vědecké literatuře by se asi našlo málo podobně ostrých formulací. Čtení je to možná zábavné, ale problém výlevu acetylcholinu se tím z místa nepohnul.

Přenesme se proto o několik let dopředu, opět do Gif-sur-Yvette, k proteolipozomům naplněným volným acetylcholinem, s mediátoforem v membráně. Zde se možná rozhoduje o budoucnosti vezikulární teorie. A skutečně, hned první pokusy naznačují, že proteolipozomy bez mediátoforu žádný acetylcholin neuvolňují, ale proteolipozomy s mediátoforem uvolňují acetylcholin způsobem zcela srovnatelným s normálním nervovým zakončením. Tyto výsledky však mají jeden nedostatek: zatím se nepodařilo zjistit, zda je tento výlev kvantový. Avšak vzhledem k tomu, že je silně závislý na přítomnosti vápníku, což je průvodním jevem kvantového výlevu (ale i nekvantového, jak ukázal F. Vyskočil se spolupracovníky), lze předpokládat, že se to brzy podaří prokázat. To by pak znamenalo, že ke kvantovému výlevu není vezikul třeba.

Můžeme tedy nyní zavrhnout Katzovu vezikulární teorii? V té formě, v níž byla formulována před čtyřiceti lety, asi ano. Přesto ale měl tento vědec pravdu. Vzpomeňte na jeho přednášku v Gif-sur-Yvette...

Starý pán se dosud zajímá o veškeré práce týkající se synaptické transmise a zůstává v těsném kontaktu se všemi, kteří v tomto oboru pracují. Často bývá žádán o odborné posudky a nedávno, těsně před vánocemi 1995, vysoce ocenil práci vycházející právě z Dunantovy laboratoře. Zřejmě mu nejde o to, aby měl za každou cenu pravdu, spíše mu leží na srdci, aby věda zůstala objektivním nástrojem hledání a odkrývání pravdy. Ať už to s těmi váčky (vezikulami) dopadne jakkoliv, sir Bernard Katz zůstává vzácným člověkem.