O šíření signálů v živých organizmech

Ryba vyrábějící elektřinu vyvolává první konflikt

Historie našich znalostí o mechanizmech odpovědných za tento typ přenosu signálu v živých organizmech je úzce spjata s výzkumem bioelektrických vlastností jedné prazvláštní ryby, zvané rejnok elektrický. O jeden z prvních popisů této ryby se zasloužil německý cestovatel Engelbert Kaempfler (1651 - 1716), který o rejnokovi vyskytujícím se v Perském zálivu (Torpedo sinopersicus nebo T. panthera) napsal zprávu přímo hrůzostrašnou: ...jedním slovem, budete mít pocit, že vaše hlavní klouby byly zpřelámány... Tak silná a prudká je síla té ukrutné exhalace, že jako mrazivá blesková střela proletí tím, kdo se ho (rejnoka) dotkne. Pochopitelně, že poněkud přeháněl. Faktem však zůstává, že množství elektrické energie, kterou je rejnok schopen uvolnit, je obdivuhodné. Pro člověka může být setkání s rejnokem skutečně velice nepříjemné, ale rozhodně ne životu nebezpečné. Ve vodě používá tato zvláštní ryba svých podivuhodných schopností k omámení a někdy i k zabití menších ryb, které pak v klidu pozře. Pochopitelně, že pro elektrofyziology byl (a stále ještě je) rejnokův elektrický orgán cenným výzkumným materiálem. A je zajímavé, kolik protichůdných názorů a kolik vědeckých sporů během studia této zvláštní ryby vzniklo.

Vraťme se zpět k našemu dobrému známému z první části vyprávění, k Luigimu Galvanimu. Pozorný čtenář si možná pamatuje, že Galvani věřil, že elektrická energie způsobující svalovou kontrakci se nachází v organizmu samém, pouze se v něm nějakým způsobem přeměňuje na energii mechanickou. Dnes víme, že jeden ze základních mechanizmů tohoto jevu je úzce spjat právě se synaptickým přenosem. A víme též, že vždy nemusí jít o přeměnu elektrického signálu (akčního potenciálu) na mechanickou energii (svalovou kontrakci). Často vede synaptický přenos k přeměně jednoho elektrického signálu na jiný elektrický signál. Jak uvidíme dále, rejnok je toho názorným příkladem.

Galvani měl ve své době velikého odpůrce. Byl jím Alessandro Volta (1745 - 1827), který názoru Galvaniho, že organizmus je sám zdrojem své vlastní elektrické energie, tvrdošíjně odporoval. Tvrdil totiž, že to, co Galvani považuje za elektrické projevy organizmu, pochází ve skutečnosti z vnějšku a je organizmu předáváno během dotyku kovovým předmětem, v tomto případě Galvaniho skalpelem. Spor to byl ukrutný a trval mnoho let. Oba se již tehdy oháněli elektrickými vlastnostmi rejnoka a oba je používali pro podepření svých vlastních teorií. Další vývoj dal za pravdu Galvanimu. Definitivní objasnění mechanizmů, které umožňují rejnokovi vyrábět si vlastní elektrickou energii, však přišlo až za více než sto let.

Objev učiněný za pouhé tři týdny

V oblasti Bordeaux, na břehu jakéhosi jezera, do kterého se na jedné straně vlévá řeka Leyre a z druhé strany je spojeno s Atlantikem, leží příjemné rekreační středisko Arcachon. Dvakrát denně, při přílivu a při odlivu, se v tomto jezeře mění slanost vody. To byl kdysi hlavní důvod, proč byla v Arcachonu vybudována Biologická stanice, která se zabývá studiem mechanizmů umožňujících zdejším živočichům adaptaci na stále se měnící životní podmínky. Zde se těsně před vypuknutím druhé světové války sešli tři známí fyziologové. Dva z nich, David Nachmansohn a Wilhelm Feldberg, byli němečtí Židé, kteří již několik let předtím opustili nacistické Německo. Tím třetím byl Albert Fessard, známý neurofyziolog z College de France. Nachmansohn tehdy pracoval na Sorbonně a jako většina jeho kolegů byl i on silně ovlivněn pracemi O. Loewiho, H. Dala a dalších, kteří nedlouho předtím poukázali na zásadní úlohu acetylcholinu v synaptickém přenosu. Dale je nazval synapse cholinergické. V té době již byly známy synapse fungující na základě jiného neurotransmiteru, noradrenalinu - ty nazval synapse adrenergické.

Začátkem léta 1939 se rozhodl Albert Fessard pozvat svého kolegu Nachmansohna do Arcachonu, kde jim v místní biologické stanici bylo k dispozici téměř neomezené množství rejnoků. Nachmansohn rád souhlasil, protože se mu v hlavě honily podobné myšlenky jako Fessardovi. Oba byli totiž přesvědčeni, že rejnokův elektrický orgán pracuje na stejném principu jako obyčejná nervosvalová cholinergická synapse, tedy na základě výlevu acetylcholinu z nervových zakončení inervujících elektrický orgán. V Arcachonu se k nim připojil mladý Dalův spolupracovník W. Feldberg (dle samotného Feldberga přijel hned na začátku, dle Nachmansohna až po prvním týdnu), který byl specialistou na stanovování acetylcholinu. Času bylo málo a tak se okamžitě pustili do práce. Výsledkem jejich přibližně třítýdenní spolupráce byla slavná a dodnes citovaná práce: The cholinergic nature of the nerves to the electric organ of the Torpedo. By: W. Feldberg and A. Fessard ¹⁾ . Pozorný čtenář poznal jistě již z názvu, že se tehdy v Arcachonu podařilo prokázat, že synapse v rejnokově elektrickém orgánu jsou skutečně cholinergické, jinými slovy, že si rejnok dokáže vyrábět vlastní elektřinu „spalováním“ acetylcholinu. Čtenáře možná zároveň překvapilo, že pod touto slavnou prací jsou podepsáni pouze dva ze tří tehdy přítomných.

Rejnokovy elektrické výboje vyvolávají další skandál

Je dnes těžké zjistit skutečné důvody, které vedly Feldberga a Fessarda k publikování společné práce bez Nachmansohna. Faktem je, že Nachmansohn odjel ještě na podzim 1939 z Francie, pro něho nejisté, na Univerzitu v Yale ve Spojených státech. Feldberg se z Arcachonu vrátil přímo do Anglie, kde žil jako emigrant již od r. 1933. Vypuknutí války pak komunikaci mezi bývalými arcachonskými spolupracovníky téměř znemožnilo. Nachmansohn pokračoval ve své práci samostatně, ale jeho názory na roli acetylcholinu se začaly silně vzdalovat názorům jeho někdejších kolegů. Fessard s Feldbergem přesto byli rozhodnuti výsledky arcachonských pokusů publikovat, protože je právem považovali za objevy zásadního významu. S Nachmansohnem však bylo stále těžší se dohodnout, jednak pro komunikační potíže způsobené válkou, jednak pro jeho nový pohled na roli acetylcholinu v bioelektrických systémech. Nachmansohn začal zastávat názor, který pak už nikdy nezměnil a se kterým jeho bývalí spolupracovníci hluboce nesouhlasili, a to že acetylcholin je odpovědný za veškerou elektrickou aktivitu všech excitabilních buňek. Fessard a Feldberg tedy usoudili, že slib o společné publikaci, který si původně v Arcachonu dali, je již vlastně splněn tím, že na sjezdu Fyziologické společnosti v Londýně byla práce přednesena jako společná a že i její krátké resumé vyšlo jako společné dílo všech tří autorů ²⁾ . A protože další práce na rukopise byla z důvodů uvedených výše téměř znemožněna, publikovali Fessard s Feldbergem pouze pod svými jmény tu část experimentů, o kterých se domnívali, že se o ně v Arcachonu nejvíce přičinili právě oni dva. Když se to Nachmansohn dověděl (prý až v roce 1946, to se nám ale zdá být dosti nepravděpodobné), byl hluboce zklamán a roztrpčen. Vleklý spor, který tím vznikl a který se později ještě přiostřil, zejména vinou rozdílného vývoje vědeckých názorů, se nikdy nepodařilo vyřešit a trval nepřetržitě až do r. 1983, kdy Nachmansohn zemřel.

Mám před sebou materiály (které by vydaly na několik dalších pokračování), mezi nimi i dlouhý Nachmansohnův dopis z 20. 8. 76, v němž vysvětluje účastníkům konference, konané z historických důvodů právě v Arcachonu, jak došlo k opomenutí jeho jména v oné historické publikaci. Z dopisu zde cituji jen jednu jedinou větu: Článek, který jsme my tři společně napsali, vyšel pak v Journal of Physiology s malou obměnou: mé jméno bylo opomenuto. Feldberg odpověděl Nachmansohnovi dopisem datovaným 18. 4. 77. Tvrdí v něm - jak také jinak - že Nachmansohn sám své spoluautorství odmítl a že pokusy, které v Arcachonu dělal, chtěl publikovat sám pouze pod svým jménem. Zbytek nechť si uveřejní Fessard s Feldbergem samostatně. Samozřejmě dodnes není jasné, jak to tehdy vlastně všechno proběhlo. Jisté a důležité je však to, že tak jako spor Galvani versus Volta, byl i spor Nachmansohn versus Feldberg a Fessard spojen s vědeckými objevy zásadního významu. A to ještě dávno nebyl všem objevům, ale ani sporům spojeným s výzkumem kolem rejnoka konec. Jako by ta zvláštní ryba měla schopnost pomást hlavy všem, kteří se snaží proniknout do jejího tajemství.

V době, o které mluvíme, ovlivnily pokrok v elektrofyziologickém výzkumu dva důležité faktory. Prvním z nich byl rozvoj nových citlivých měřicích přístrojů (na tom měl hlavní podíl válečný výzkum). Druhým faktorem bylo zdokonalení elektronového mikroskopu do té míry, že ho bylo možno používat i v biologii.

Jak vznikají miniaturní postsynaptické potenciály

Použití nových citlivých zesilovačů, schopných registrovat a zpracovávat slabé bioelektrické signály, přineslo mnoho nových a překvapujících objevů. O jeden z nejdůležitějších se postarali Paul Fatt a Bernard Katz, kteří se zabývali výzkumem změn postsynaptického potenciálu v nervosvalové synapsi. Používali k tomu metodu vyvinutou koncem čtyřicátých let, která spočívala v tom, že se skrz buněčnou membránu postsynaptické buňky, v jejich případě svalové, vpíchla do intracelulárního prostoru nesmírně tenounká elektroda (o průměru menším než půl tisíciny mm). Druhá elektroda se umístila vně buňky a obě se pak přes citlivý zesilovač připojily k osciloskopu. Cílem Fattových a Katzových pokusů bylo zjistit, jak se mění postsynaptický potenciál během dráždění presynaptického nervu. Jinými slovy jim šlo o to, změřit elektrickou odpověď postsynaptické membrány na signál přicházející z membrány presynaptické.

Jednoho dne, zatímco jeden z nich přibližoval a připevňoval dráždicí elektrody k nervům, přepínal druhý z nich zesilovač na maximální zesílení, aby v okamžiku dráždění mohli sledovat změny na postsynaptické membráně s co nejvyšší citlivostí. Vše se zdálo být v pořádku a vypadalo to, že je možno začít s drážděním. Poslední pohled na obrazovku osciloskopu však ukázal, že signál je nějaký nečistý; objevily se na něm krátké náhodné impulzy, přicházející kdoví odkud. To nám ještě scházelo, řekli si a snažili se zjistit zdroj těchto nepříjemných perturbací aniž tušili, že právě pozorují jev, kterým se brzy oba proslaví. Dívali se na obrazovku a nadávali na ten nepříjemný šum, který jim znečišťoval záznamy a kterého by se byli rádi zbavili, jen kdyby věděli jak. Jedno jim ale bylo divné; běžný šum měl obsahovat impulzy o různých amplitudách, kladných i záporných. Impulzy na obrazovce však byly všechny kladné (obrázekA). Katz po chvíli přepnul časovou základnu a na obrazovce se objevily krásné pravidelné depolarizující signály, které obyčejný šum v ničem nepřipomínaly (obrázekB). Nebudeme čtenáře dále napínat. Jak později Fatt s Katzem zjistili, nešlo o žádné perturbace způsobené vnějšími vlivy. Zdánlivě záhadné elektrické signály měly svůj původ v postsynaptické membráně. Oba vědci se pak studiu tohoto jevu věnovali po několik let a zjistili, že amplituda těchto miniaturních potenciálů je v podstatě neměnná, že se však za určitých okolností může zvýšit, ale pouze na přesně dvou-, tří-, čtyř-, nebo výjimečně pětinásobek základní amplitudy, která je kolem 0,5mV. Fatt s Katzem usoudili, že tyto postsynaptické miniaturní potenciály jsou způsobeny náhodným uvolňováním jednoho, dvou či více malých ale konstantních kvant acetylcholinu z presynaptické membrány. Své výsledky, doplněné o důkladnou matematicko-statistickou analýzu, uveřejnili r. 1953 ³⁾

Synaptické váčky neboli vezikuly

V poválečných letech se v biologickém výzkumu začínal stále více uplatňovat elektronový mikroskop. V letech 1953 - 56 vyšlo ze čtyř na sobě nezávislých laboratoří několik prací, v nichž autoři uveřejnili fotografie nervového zakončení pořízené právě touto novou hračkou moderních morfologů. Na všech bylo možno v intracelulárním prostředí rozeznat jakási zakulacená pouzdérka o velikosti kolem padesáti nanometrů, tedy 50 miliontin milimetru, což optickým mikroskopem používaným do té doby bylo nezobrazitelné. Jedním z vědců, kteří publikovali obrázky znázorňující tyto synaptické váčky, byl D. Robertson, jehož laboratoře na University College v Londýně byly v těsné blízkosti laboratoří B. Katze. Oba vědci se dobře znali. Katz si jednoho dne prohlédl Robertsonovy fotografie a v hlavě mu vzklíčil nápad. S kolegou J. del Castillem pak uskutečnil řadu pokusů a o rok později spolu uveřejnili přehledový článek ⁴⁾ , ve kterém mimo jiné říkají: ...Jiné a asi daleko jednodušší vysvětlení pro kvantové uvolňování acetylcholinu nám napovídá přítomnost submikroskopických ... vezikul uvnitř nervového zakončení... Je možno si představit, že takovéto partikule by mohly ... uvolnit celý svůj obsah acetylcholinu ... V těchto několika větách je obsažena celá slavná vezikulární teorie. Pouze však teorie, nebo dokonce jen hypotéza, experimentálně zatím neprokázaná. Snímky synaptických váčků však byly tak přesvědčivé, a postsynaptické miniaturní potenciály se vyznačovaly tak krásně stálou amplitudou, že představa konstantních kvant acetylcholinu uskladněných uvnitř vezikul a občas náhodně uvolněných do synaptické štěrbiny byla velmi lákavá. Nebýt Castilla a Katze, asi by se dříve či později našli jiní, kteří by navrhli podobnou teorii. Nebylo ani divu, že se ujala neobyčejně snadno a rychle. Zbývalo už jen experimentálně ji potvrdit. Do toho se pustilo hned několik laboratoří najednou, ale o tom už si povíme příště. Dnes jen prozradíme, že ani tentokrát nebyla porušena tradice, takže výzkum spojený s rejnokem přinesl opět svou dávku objevů i vědeckých sporů vysoké úrovně.