Otec buněčného dělení

Jubilejní 100. Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství získali Leland Hartwell, Tim Hunt a sir Paul Nurse „za objevy klíčových regulátorů buněčného cyklu“. Nemohu zamlčet, že mne tato zpráva potěšila víc, než bývá v podobných případech obvyklé. Společenství vědců, kteří se zabývají zkoumáním kteréhokoli konkrétního tématu – v našem případě buněčného cyklu (tedy pochodů, které jsou základem veškerého buněčného rozmnožování, růstu tkání a koneckonců i rakovinného bujení) – je jako poměrně malá vesnice. Každý zná každého aspoň podle jména, a často i z osobního styku. Přistane-li nejvyšší vědecké ocenění v centru takové komunity, přenese se kousek radosti i na ty, kdož s nobelovským objevem neměli společného nic víc než příslušnost k společenství (krajanům „zlatých hochů z Nagana“ netřeba o pocitech tohoto druhu mnoho vyprávět).

Od bakteriofága k cdc-mutacím

Mé první setkání se jménem Lee Hartwella se událo v časech, kdy jsem sotva začínala tušit, že se někdy budu zabývat zkoumáním buněčného cyklu. Bylo to roku 1984, právě jsem se na přelomu 1. a 2. ročníku dychtivě přihlásila o budoucí diplomní téma. Záhy jsem narazila na Hartwellovy brilantní studie z přelomu 60. a 70. let. Právě tyto práce založily genetiku buněčného cyklu a svému autorovi kromě letošní Nobelovy ceny vynesly i přízvisko „otec buněčného dělení“, které mu v rozhovoru pro časopis Nature udělil jeden z jeho kolegů Mitsuhiro Yanagida. ¹⁾ Abychom pochopili, co se koncem 60. let v Hartwellově laboratoři na Kalifornské univerzitě v Irvine odehrálo, musíme se vrátit téměř o desetiletí zpátky. Během oné desítky let absolvoval Lee Hartwell studium na prestižní Kalifornské technice. Tam se stal žákem jednoho z klasiků časného údobí fágové genetiky Boba Edgara, který spolu s Billem Woodem a Maxem Delbrückem popsal posloupnost událostí vedoucích k tvorbě infekční fágové částice. Právě v Edgarově skupině se zrodila představa, že vznik složitých biologických struktur lze popsat jako posloupnost oddělených kroků, které na sebe navazují jako jednotlivé úkony na montážní lince. Organizaci „montážní linky“ můžeme pochopit, jestliže získáme mutanty, kteří za určitých okolností – třeba za zvýšené teploty – nedokážou provádět určité úkony, protože spolu se zablokovaným krokem přestanou fungovat i všechny kroky následující, kdežto děje na nezávislých větvích „linky“ běží nerušeně dál.

Po studiu na Kalifornské technice pokračuje Hartwell doktorátem na Massachusettské technice, kde se pod vedením Borise Magasanika věnuje studiu regulace genové funkce (a utvrzuje se ve svém celoživotním přesvědčení, že to nejcennější, co může učitel studentovi předat, je smysl pro samostatné kladení otázek a řešení problémů). Když se pak rozhoduje o své profesionální budoucnosti, uvědomuje si, že by si měl vybrat problém, který ho uživí po zbytek aktivní kariéry; to ho přivádí do laboratoře Renata Dulbecca, zaměřené na výzkum dělení savčích buněk a na problém vzniku rakoviny. Módním experimentálním přístupem ve studiu eukaryontních buněk je v tu dobu heroická biochemie velkých objemů a vysokých dávek radioaktivních značek, molekulární genetika se teprve rodí a zdá se, že je doménou bakteriologů – na klasickou mendelovskou genetiku se hledí jako na obor, který má nejlepší léta dávno za sebou.

Lee Hartwell odchází na své první asistentské místo na Univerzitě v Irvine s pocitem, že jej současný stav zkoumání buněčného cyklu neuspokojuje. V době mezi zařizováním, kdy musí dlouhé týdny čekat na objednané přístroje, vysedává v knihovně, rozmlouvá s kolegy a přemýšlí. Náhodná poznámka kolegy Dana Wolfa („Proč tedy neděláš na něčem, na čem se dá dělat genetika?“) ho přivádí k pučivé kvasince Saccharomyces cerevisiae, která má mimo jiné tu výhodu, že spokojeně roste na stole v polozařízené laboratoři a nevyžaduje termostat s kontrolovanou atmosférou jako savčí buňky.

Lee Hartwell se rozpomíná na svá studentská léta a pouští se do izolace kvasinkových mutantů citlivých k zvýšené teplotě, podobně jako když s Bobem Edgarem hledal mutanty bakteriofága. Doufá, že moderními biochemickými metodami identifikuje mutanty s poruchou replikace DNA, ale zanedlouho si uvědomuje možnosti svého nového modelu. Při pohledu na mikroskopické fotografie kvasinkové kultury ho totiž napadá, že z tvaru kvasinkové buňky – zejména z velikosti jejího pupenu – lze se značnou přesností odečíst, ve kterém stadiu buněčného cyklu se kvasinka právě nachází. Učiní pak vskutku odvážný krok zpět – jeho hlavním nástrojem je od této chvíle nikoli opěvovaná biochemie, ale „pouhý“ mikroskop a misky na počítání kolonií, jaké měl k dispozici kdekterý genetik či mikrobiolog o generaci starší. Hartwell a jeho škola sice možná používají starobylé metody, ale stavba jejich experimentů a otázky, na které se snaží odpovědět, jsou ryze moderní.

Postupem doby Hartwell se svými studenty identifikuje řadu kvasinkových mutací se specifickou poruchou buněčného cyklu, které označí jako mutace cdc (cell division cycle). Mutace každého CDC-genu vede za zvýšené teploty k zástavě cyklu v charakteristickém stadiu, což se projeví na tvaru buňky. Kombinací klasických genetických a fyziologických metod se pak Hartwellovi podaří stanovit i pořadí funkcí jednotlivých genů. Získává tak obraz buněčného cyklu jako soustavy zesítěných a propojených „montážních linek“. Zjišťuje, že zablokování kteréhokoli kroku brání průběhu všech následujících a že každý CDC-gen vystupuje v síti jednou, s výjimkou genu, který získal nenápadné označení CDC28. Právě CDC28 se účastní nejméně dvou kroků cyklu (oba jsou spojeny s důležitým rozhodnutím) – jednak odstartování pochodů vedoucích k pučení a replikaci DNA, jednak zahájení mitotického rozchodu chromozomů. Jedinou „vadou na kráse“ modelu, jíž si byli Hartwell a jeho kolegové vědomi a kterou otevřeně přiznávali, je netypické chování jednoho z mutantů neschopných replikace DNA. Mutantní buňky dokážou opakovaně pučet i bez dělení jádra (dokonce s frekvencí víceméně odpovídající normálnímu trvání cyklu), což ukazuje, že se na kontrole časování buněčného cyklu podílí i další mechanizmus, který model „výrobní linky“ nevysvětluje – jakési centrální „buněčné hodiny“.

Revoluce, o které se nemluví

Hartwellovy mistrovské genetické pokusy se sice setkávají s uctivým přijetím (celá série publikací je završena velkým přehledným článkem v Science), avšak většina vědecké veřejnosti se tváří dosti rozpačitě, když dojde na otázku, zda závěry získané studiem kvasinek mohou mít obecnější platnost.

Mezitím totiž nastupují léta osmdesátá a na druhém konci světa Tim Hunt – mlčenlivý „umělec buněčného dělení“ (za přezdívku může opět M. Yanagida) – zkoumá biochemické pochody v dělících se oplozených žabích vajíčkách. Je vskutku až s podivem, jak málo toho o Huntovi veřejnost ví, nepočítáme-li jeho početné odborné publikace. Na rozdíl od obou spolunositelů jubilejní Nobelovy ceny nedostal v minulosti žádné ocenění, které by s sebou neslo poskytování rozhovorů pro tisk, a nikdy nezastával veřejně viditelnou funkci. Úcta, kterou jeho jméno vzbuzovalo už před několika lety, je však přímo hmatatelná – a zjevně podmíněná nejen tím, že dlouhou dobu seděl v redakční radě nejprestižnějšího biologického časopisu Cell.

V roce 1983 nachází Tim Hunt specifickou bílkovinu, která se objevuje a zase mizí před každým buněčným dělením, a dává jí název cyklin. Tato bílkovina se chová, jako by byla součástí hypotetických „buněčných hodin“, které řídí průchod cyklem a přinejmenším v takových situacích, jako je rychlé rýhování oplozeného vajíčka, nedbají na to, zda byly předchozí funkce dokončeny. (Těžko tuto představu smířit s Hartwellovou posloupností přísně provázaných dějů!) Také Huntova práce navazuje na úctyhodnou tradici, tentokrát biochemickou. Ukazuje se, že cyklin je součástí proteinového faktoru MPF (mitosis promoting factor), který v 70. letech – tedy v době, kdy Hartwell konstruoval své posloupnosti cdc funkcí – objevil Yoshio Masui. ²⁾

MPF ovšem není jen cyklin: druhou podstatnou složkou je proteinkináza, kterou nyní známe jako CDK (cyclin-dependent kinase) a která o něco později měla hrát klíčovou roli. Zatím (v polovině let osmdesátých) se však celá oblast studia buněčného cyklu zdá být beznadějně rozdělená mezi dvě školy, které si sice vzájemně uctivě naslouchají, ale jako by neměly nic společného. Mé zalíbení v Hartwellových cdc-mutantech mi r. 1986 málem vyneslo malér u zkoušky, když jsem na otázku „regulace buněčného cyklu“ vysypala hartwellovskou funkční posloupnost místo očekávaného vyprávění o cyklinech, které se mi zdály být nudné, protože se o nich tehdy vědělo jen to, že jsou součástí MPF a periodicky se objevují a mizí. Zkoušející mne chvíli poslouchal, a pak mne přerušil slovy: „No tak, nechte už těch kvasinek a povězte mi něco o pořádných eukaryontech.“ Vyjádřil tím jen obecné přesvědčení oné doby. I v předmluvě k poměrně prestižní monografii o buněčném dělení z r. 1985 se dočteme, že nejjednodušší způsob jak se vyrovnat s nesouladem mezi Hartwellovým modelem přísně regulovaných funkčních posloupností a „hodinovým“ modelem cyklu řízeného aktivitou MPF je předpokládat, že regulace buněčného cyklu u kvasinek a u živočišných buněk nemá vůbec nic společného.

Zanedlouho poté však celou oblastí výzkumu buněčného cyklu otřese událost, která by si zasloužila místo v historii kuhnovských vědeckých revolucí. Hlavní roli v ní hraje právě britský molekulární biolog Paul Nurse (tehdy ještě nikoli sir Paul; také Yanagidova přezdívka „kazatel“ je zatím záležitostí daleké budoucnosti). Jeho skupina se vzápětí po Hartwellovi pouští rovněž do hledání cdc-mutantů – tentokrát u poltivé kvasinky Schizosaccharomyces pombe, v naději, že tento modelový organizmus je přinejmenším svým způsobem rozmnožování bližší živočišným buňkám než pučivá kvasinka. Práce na poltivých kvasinkách sice vede k terminologickému zmatení, kterým celá oblast bádání dodnes trpí (existují totiž dvě nezávisle číslované sady cdc-mutací ze dvou různých kvasinek), ale zanedlouho přináší zásadní objev. Tím je zjištění, že gen označovaný jako cdc2, který se účastní zahájení mitózy a zřejmě zprostředkovává i přizpůsobení tempa buněčného dělení rychlosti růstu, odpovídá genu CDC28 pučivé kvasinky. A co více: savčí homolog tohoto genu kóduje onu kinázu, která je součástí komplexu MPF odpovídajícího za koordinaci buněčného cyklu.

Anomálie Hartwellova modelu najednou dávají smysl. Je-li produkt genu CDC28 ústřední součástí „buněčných hodin“, lze očekávat, že se porucha jeho funkce projeví ve více stadiích cyklu – všude tam, kde „hodiny“ přímo kontrolují další události, jako je třeba replikace či rozchod chromozomů. ³⁾ A netypičtí mutanti, kteří opakovaně pučí i bez dělení jádra? Ti přece připomínají chování oplozeného vajíčka, které se také neohlíží, zda byly předchozí kroky cyklu náležitě dokončeny. Míra závislosti chodu „hodin“ na strukturních událostech cyklu může být zkrátka v různých situacích a systémech různá. Zdánlivá neslučitelnost dosavadních dvou představ o buněčném cyklu je vyřešena – jejich splynutím.

Jak to, že se o této přímo ukázkové změně paradigmatu, kterou zahájily Nursovy práce z r. 1987 a završil r. 1988 přehledný článek v časopise Science z pera Andrewa Murraye, ⁴⁾ dnes téměř neví? Nejsem sociolog vědy, ale zdá se mi, že odpověď může být v tom, že vědecká revoluce vstoupí do obecného povědomí jen tehdy, když jsou její protagonisté na své dílo patřičně hrdí. Jinak řečeno: Mezi zrozením a pádem „starého“ paradigmatu musí uplynout dost času na to, aby vyrostla aspoň jedna generace vědců ochotných stavět svou kariéru na vyvracení teorií vlastních učitelů. To se v případě buněčného cyklu nestalo – tam se na překonání starých modelů podíleli titíž autoři, kteří je zhruba deset let předtím formulovali.

Stranou celé debaty kolem rozluštění funkce MPF a následné fúze dvou klasických modelů buněčného cyklu však zůstal Lee Hartwell. Ne že by ho „cyklová“ problematika přestala zajímat; naopak. Ve stejném čísle Science jako Andrew Murray publikoval rozsáhlý přehled, v němž shrnuje výsledky z další oblasti výzkumu, kterou v mezidobí stačil založit.

Komunikace se světem a složité biologické systémy

Z Hartwellova modelu buněčného cyklu – poprvé v dějinách biologie – vyplynula možnost zkoumat regulaci konkrétních genů, které se účastní řízení buněčného dělení (k tomuto tématu viz též Vesmír 79, 24, 2000/1 a Vesmír 79, 563, 2000/10).

Již dlouho před objevem spojení s MPF bylo zřejmé, že kvasinkový gen CDC28 hraje výjimečnou roli – nejen že se podílel na několika krocích cyklu, ale účastnil se právě těch kroků, kde buňka činí nezvratná rozhodnutí (jednou zahájená replikace či mitóza se už musí dokončit). Zároveň buňka musí „brát v úvahu“ svůj vlastní fyziologický stav a informace z okolí. Jedním ze známých faktorů ovlivňujících aktivitu CDC28 pak je přítomnost pohlavních feromonů – krátkých peptidů, které haploidní kvasinky vysílají do prostředí a podávají tak „zprávu“ o své přítomnosti potenciálnímu sexuálnímu partnerovi. Ten pak na feromonový impulz odpoví tím, že zastaví buněčné dělení a připraví se k splynutí s partnerskou kvasinkou.

Odpověď kvasinkové buňky na feromony se v 90. letech stala vůbec první kompletně molekulárně charakterizovanou dráhou přenosu signálu od receptoru na buněčném povrchu až po transkripčně regulované geny v jádře. Málokdo si však pamatuje, že jedním z badatelů, kteří tuto oblast výzkumu odstartovali, byl Lee Hartwell.

On sám totiž u „feromonového“ modelu příliš dlouho nevydržel. Jednoho z jeho studentů Teda Weinerta, kterého původně do Hartwellovy laboratoře přilákala právě možnost zabývat se regulací buněčného cyklu, totiž upoutal paradox, který se stal zřejmým po naklonování a osekvencování několika CDC­genů z původní Hartwellovy sbírky. Proč vyvolává porucha funkce některých enzymů, potřebných v širokém časovém okně v buněčném cyklu, specifické zablokování mitotického rozchodu chromozomů? Nemůže to být důsledek existence mechanizmů, které buňce dovolují sledovat vlastní stav a v případě poškození důležitých struktur (např. DNA) pozastaví průchod cyklem, dokud se porucha neopraví?

Hartwellovi a Weinertovi se vskutku podařilo prokázat přítomnost takových mechanizmů – tzv. checkpoints. ⁵⁾ Právě o nich byl již zmiňovaný článek z roku 1988. Celá oblast studia zpětnovazebných kontrol průběhu buněčného cyklu je dodnes velice živá a produktivní, i když se zaměření výzkumu postupně přesouvá od kvasinek k živočišným buňkám. Zdá se totiž čím dál pravděpodobnější, že narušení schopnosti náležitě reagovat na poškození může hrát významnou úlohu při vzniku rakoviny.

Své oblíbené kvasinky ostatně postupně opouští i Lee Hartwell. Od poloviny 90. let se vrací k svému dávnému snu – zkoumání rakovinných buněk. Ne že by zde nemohl uplatnit kvasinkový model. Sám říká, že nakonec vždycky dospěje k nějaké základní otázce, která se dá nejlíp řešit na kvasinkách. Od výsledku je ale třeba postupovat zpět, k složitějším systémům, což už je záležitost koordinovaného úsilí řady výzkumných týmů. To už není úkol pro jednu laboratoř, ve které mají studenti maximum tvůrčí volnosti.

Zkrátka jak sám Lee Hartwell rád přiznává, ve chvíli, kdy se stal ředitelem Hutchinsonova střediska pro výzkum rakoviny, zapletl se s pěkně složitým biologickým systémem. Taková pozice už nenechává mnoho času pro vlastní experimentální bádání. Pořád ještě ale zbývá nějaký čas na vymýšlení překvapujících hypotéz, snad inspirovaných netušenou složitostí buňky i lidského světa.

Zatím naposled rozčeřil Lee Hartwell vědecké vody na přelomu let 1999 a 2000, když v časopise Nature spolu s H. Hopfieldem, S. Leiblerem a nám již známým A. Murrayem publikoval programový článek s názvem „Od molekulární biologie k biologii modulární“. ⁶⁾ Biologie budoucnosti by se podle Hartwella a jeho kolegů měla soustředit nikoli na snahy o úplný popis fungování buňky, založený na rozluštění a charakterizaci funkcí jednotlivých molekul, ale na studium nové, dosud nepopsané organizační úrovně, stejně svébytné, jako je úroveň buněčná: totiž nitrobuněčných strukturních a regulačních modulů. Některé moduly se překrývají se známými molekulárními komplexy, modul však nečiní modulem soudržnost strukturní, ale funkční, a k jeho studiu se lépe hodí metody klasické genetiky než módní biochemie (že to něco připomíná?). To, na čem záleží, není totiž vnitřní uspořádání modulu (ten může zastupovat černá skříňka), ale způsob, jakým je zapojen do sítě vztahů s jinými moduly a prostředím.

A nejen to: díváme-li se na životní funkce buňky očima modulární biologie, nemůžeme přehlédnout, že si zpracovávání řady vnějších i vnitřních signálů v síti buněčných modulů svou složitostí nezadá s úkoly, které dnes a denně řeší naše nervová soustava. Existují snad nějaké moduly, které by byly buněčnou obdobou mozku?

Jestliže připustíme tuto metaforu se vším, co z ní plyne, musíme připustit i to, že buněčná biologie může jednoho dne čerpat z bohatého arzenálu metod, jimiž disponují ti, kteří se zabývají nejrůznějšími aspekty činnosti lidského mozku a mysli.

Dveře jsou přinejmenším pootevřeny

Co všechno jimi může vstoupit? Bude to jen neurofyziologie, kybernetika a podobné „skoroexaktní“ vědy? Nebo budeme jednoho dne studovat buněčné procesy metodami vypůjčenými z rozsáhlého a nepřehledného světa humanitních oborů, jichž se mnozí přírodovědci tak úzkostlivě straní?

Taková představa se může zdát na první pohled absurdní. Uvědomme si však, jak málo by zbylo z celého bohatství vědeckých poznatků, kdybychom se museli rozloučit se vším, co dává smysl pouze tehdy, když připustíme, že námi zhotovené mechanizmy jsou adekvátním modelem pro pochopení živých tvorů. Jsme snad my sami horším modelem biologického světa než mechanické a elektronické stroje?

Nevím. Nevím ani, zda si tuto otázku takto klade Lee Hartwell. Není ostatně filozof, ale praktikující vědec.

Vím jen, že ze zásadních otázek, které formuloval, vždycky vylezlo něco hodně zajímavého.