Posviťme si na molekuly

Spektroskopie se může na první pohled jevit jako velmi jednoduchá metoda: posvítíme na vzorek, získáme spektrum a z něj vyčteme informace o kvalitativním a kvantitativním složení studovaného materiálu. Už druhý pohled ale odhalí mnoho netriviálních detailů, jejichž pochopení a využití vyžaduje spolupráci odborníků z různých oborů. Pokročilé spektroskopické metody rozvíjí fyzikální chemik Pavel Matějka, rektor Vysoké školy chemicko-technologické v Praze.
 

Rozhovor vychází s finanční podporou VŠCHT.

Věnujete se vibrační spektroskopii. Co si pod ní máme představit? — Vibrační spektroskopie se zaměřuje na sledování kmitů v molekulách. Kmity si umíme znázornit makroskopicky velmi jednoduše jako kuličku kmitající na pružině. Je asi celkem snadno představitelné, že čím těžší atom je, tím kmitá pomaleji, tedy s nižší frekvencí. A atomy jsou mezi sebou spojeny vazbami. Opět asi nepřekvapí, že čím silnější je vazba, tím je amplituda onoho kmitání menší. Pokud jde o frekvenci, to už tak intuitivní není, ale silnější vazba znamená vyšší frekvenci. Vibrační spektrum tedy odráží, z jakých atomů je vzorek složen a v jakém prostorovém uspořádání atomy jsou. Dozvíme se něco o struktuře látky, a pracujeme-li se směsí, získáme také informaci o tom, kolik tam té které látky je.

V jakém směru tuto metodu rozvíjíte? — Od mládí se zabývám zesílením signálu vibračních spekter. Využíváme jednak absorpci infračerveného záření a jednak v Ramanově spektroskopii neelastický¹⁾ rozptyl ve viditelné nebo v blízké infračervené oblasti. Zvláště v Ramanově spektroskopii je signál poměrně slabý, protože na milion dopadajících fotonů získáme mezi rozptýlenými fotony jen jednotky těch, které mají jinou energii než fotony dopadající, a nesou tedy informaci o povaze vzorku. Takže zesílení signálu je důležité, ať už pro analýzu zředěných systémů, nebo pro zkrácení doby měření.

A jak na to? — Možností je více. V makroskopickém měřítku jsou to techniky povrchem zesíleného Ramanova rozptylu, respektive povrchem zesílené infračervené absorpce. K tomu se využívají kovové nanostruktury, na kterých jsou sledované molekuly deponovány. Výbornými zesilovači jsou nanostruktury stříbra, zlata, případně mědi.

A v mikroskopickém měřítku? — Pokud umíme spektroskopickou techniku zkombinovat s mikroskopií atomárních sil a zesílení signálu velmi úzce lokalizovat do velmi ostrého hrotu, jsme schopni signál v poměrně slušné intenzitě získat od objektů ne na úrovni mikrometrů, ale desítek nanometrů. To by jinak bylo zcela mimo možnosti vibrační spektroskopie.

„Zesílení povrchem“ zní trochu magicky. Jak funguje? — Řada jevů ve spektroskopii obecně je nějaký rezonanční jev, např. nukleární magnetická rezonance to má přímo v názvu.²⁾ Pro zesílení signálu využíváme vybuzení kolektivních oscilací elektronů v kovu při interakci s dopadajícím elektromagnetickým zářením, tzv. lokalizovanou povrchovou plazmonovou rezonanci.³⁾ Dochází ke generování lokálního elektrického pole, které působí na molekuly v bezprostřední blízkosti nanostruktury, a rezonancí se signál výrazně zesílí.

Prof. Dr. RNDr. Pavel Matějka (*1966)

Vystudoval fyzikální chemii na Přírodovědecké fakultě Univerzity Karlovy. Od roku 1993 působí na Vysoké škole chemicko-technologické v Praze, od 1. ledna 2020 je jejím rektorem. V letech 1995–1996 absolvoval postdoktorskou stáž ve spektroskopické laboratoři LASIR CNRS ve francouzském Thiais. V minulosti na VŠCHT vedl Ústav fyzikální chemie a v letech 2016–2019 byl prorektorem pro vnější vztahy a komunikaci. Ve své vědecké práci se věnuje vývoji technik molekulové spektroskopie se zaměřením na vibrační spektroskopii (infračervenou a Ramanovu).

Snímek Archiv VŠCHT Praha

Někdy je třeba vzorek pro měření upravit, jindy můžete měřit rovnou, bez úprav. V jakých situacích si s tímto jednoduchým přístupem vystačíte? — Záleží na tom, co od výsledku očekáváme. Pokud potřebujeme například nějakou jednoduchou identifikaci, např. odlišit etanol od metanolu, stačí nám relativně jednoduchý přenosný spektrometr a měření přes sklo lahve. Před několika lety se to hojně využívalo při metanolové aféře. Podobně pokud odhalujeme padělky léčiv, lze k tomu přistupovat velmi přímočaře.

Protože víte, co hledáte a co máte v signálu sledovat? — Ano, porovnáváme měření s databází a shoda tam buď je, nebo není.

Jak vlastně probíhá interpretace spekter? — Vzpomínám na docenta Bohuslava Straucha⁴⁾ na přírodovědě. Jako student jsem naměřil nějaká spektra, on je vzal do ruky a „přečetl je“. Tehdy jsem si říkal, jak to v tom může vidět. Ale je to zkušenostmi. Je to podobné jako s procházkou po louce. Nejprve si všimnete zelené trávy a různě barevných květů. Pokud o botanice nic nevíte, tím to pro vás končí. Můžete si vzít atlas nebo určovací klíč, sledovat barvu a počet okvětních lístků, tvar listů…, krok za krokem se doberete toho, o kterou květinu se jedná. Máte-li s tím už zkušenosti, i bez klíče poznáte na první pohled žlutý podběl od žluté pampelišky, protože mají sice stejnou barvu, ale liší se jinými vlastnostmi.

A spektrum je jako rozkvetlá louka, na které laik vidí žluté květy a botanik třeba pryskyřník prudký? — Přesně tak. Na první pohled vidíte, zda ve spektru jsou nějaké pásy. Dále si všimnete jejich šířky, polohy, vzájemných poměrů… A pokud se v tom trochu vyznáte, z řady rysů toho spektra dokážete leccos poznat. Tohle je nějaký nasycený uhlovodík, tady aromát. A tenhle uhlovodík je větvený, zde je lineární řetězec, támhle nějaká monosubstituce…

Botanici mají atlasy a klíče. Co pomáhá spektroskopikům? — Existují samozřejmě knihovny spekter a softwarové nástroje, které výrazně pomáhají. To by svádělo k myšlence, že empirické čtení spekter už dnes není potřeba. Ale pokud vám něco nesedí, je docela užitečné umět spektrum sám luštit a odhalit, co by mohlo být příčinou té odlišnosti. A také se vám pak nestane, že byste interpretoval nějaký artefakt. Člověk občas zírá, co vše se publikuje. V infračervených spektrech se například projevuje atmosférický oxid uhličitý. Výrazný pás valenčních vibrací okolo 2300–2400 cm^–1, toho si asi každý všimne. Ale vedle něj tam bývají spektrální projevy deformačního kmitu, kterému odpovídá výrazně nižší frekvence a snadno se schová v oblasti kmitů aromátů. A pokud tohle netušíte, můžete chybně interpretovat variabilitu takového pásu.

Zmínil jste softwarové nástroje. Jak konkrétně pomáhají? — Má to několik úrovní. Tou nejjednodušší jsou ony knihovny spekter, s nimiž lze naměřené spektrum porovnat. Dále jsou to softwary umožňující interpretaci spekter. Využívají prostředky typu neuronových sítí. Natrénují se na tisících spekter a jsou pak schopny dát nějaké návrhy. Ty je nicméně potřeba projít a vyhodnotit, nespoléhat se jen na algoritmy. Pokud jde o kvantitativní analýzu směsných vzorků, využívají se multivariační statistické metody. Ty na spektrum nahlížejí jako na mapu bodů v n-rozměrném prostoru, v němž porovnávají polohy těch bodů, počítají vzdálenosti mezi nimi a podobně. Takové „chemometrické“ postupy se dnes běžně používají pro porovnávání sérií vzorků, pro kinetické studie, pro analýzu spekter z různých bodů, tedy pro jakousi analýzu obrazu… Hrají důležitou roli, protože při spektroskopii v mikro- nebo nanoměřítku mohu získat z jednoho vzorku tisíce spekter a představa, že každé z nich budu prohlížet a porovnávat očima, je mimo realitu. Bez statistické analýzy se neobejdu.

Když si představím rozmanitost chemických sloučenin a funkčních skupin, točí se mi hlava. Navíc jistě hraje roli i orientace molekul vůči dopadajícímu záření. Proměnných je tolik, že je mi záhadou, jak lze spektra interpretovat s dostatečnou jednoznačností. Nemohou vzorky velmi odlišného složení dávat téměř totožné spektrum? — Velmi odlišné složení nemůže vést k prakticky totožnému spektru. Pro jeden vzorek ale mohu získat odlišná spektra. Roli může hrát řada faktorů způsobujících, že se pásy posouvají, mění intenzitu a tvar. Ze svého mládí pamatuji, že šikovní chemici cíleně využívali rozdílů v hmotnosti – prováděli izotopické substituce. Výměnou vodíku za deuterium se zvýší hmotnost, posune se pás odpovídající příslušným kmitům a pozorování efektů různých substitucí hodně napoví.

Povrchem zesílený Ramanův rozptyl a infračervená absorpce. A. Vzorek (zde riboflavin, tj. vitamin B2) je deponován na kovovou nanostrukturu, která signál zesiluje. Signál je čten pomocí velmi ostrého hrotu, což umožňuje měřit s rozlišením v řádu desítek nanometrů. B. Série spekter při různém uspořádání měření, fialově hrotem zesílený Ramanův rozptyl (TERS). C. Skenovací infračervená mikroskopie blízkého pole (SNIM) – mapa vzorku jako distribuce optického signálu v absorpčním pásu v infračervené oblasti.

Dnes už se to dělá jinak? — Od té doby neskutečně pokročila výpočetní chemie. Záměrně říkám výpočetní, a ne kvantová, protože základ v kvantové chemii tam sice je, ale uplatňuje se i řada dalších faktorů, týkajících se vlivu okolního prostředí, solvatace atd. Máme výpočetní modely umožňující simulovat, jak by experimentální spektra měla vypadat. Samozřejmě to nesedí dokonale, jsme omezeni jak mírou aproximace při výpočtech, tak kvalitou experimentů, ale pomoc je to významná. Důležité je udělat srovnávací sérii jak na úrovni výpočtu, tak na úrovni experimentu. Lze spočítat teoretická spektra pro vybranou molekulu podle toho, jak je orientována v nějakém klastru třeba stříbrných nebo zlatých atomů. Všechna tato spektra sice budou jiná než spektra experimentální, ale mohu porovnávat trendy jejich změn se sérií experimentálních dat. U povrchem zesílených spekter je báječná možnost měřit je na elektrodě, kde mohu měnit potenciál a sledovat, co se s tou molekulou děje, a opět porovnávat výsledky experimentu s výpočty.

V čem spočívají nejvýraznější pokroky spektroskopie v instrumentální rovině? — Pokročilé metody, s nimiž se člověk dříve setkal pouze ve výzkumných centrech a na univerzitách, se dnes běžně používají v průmyslu, v nemocničních nebo kriminalistických laboratořích… Od velmi složitých systémů, které zabraly celou místnost, jsme se dostali ke kompaktním přístrojům. Z mládí si pamatuji laserové trubice dlouhé dva nebo tři metry. Dnes je laser v přenosném přístroji velikostně srovnatelný s laserovým ukazovátkem. Máme miniaturní difrakční mřížky, vše důležité včetně elektroniky lze vměstnat do krabičky, kterou udržím v rukou. To je obrovský pokrok spojený ještě s jednou věcí.

A to? — Dříve se používaly systémy s jednokanálovou detekcí. Dnes máme i v přenosných přístrojích tisíce kanálů. Pokud jsme dříve měřili třeba 3600 kanálů jeden po druhém, každý sekundu, dnes všechna tato měření můžeme udělat najednou a z hodiny jsme rázem na sekundě. Pro mnoho účelů dnes měření trvající řádově sekundy stačí – a to už v rukou udržím. V šedesátých letech se používala výbojka a fotografický záznam, měření jednoho spektra trvalo třeba týden. V osmdesátých letech se měření zkrátilo na hodiny a dnes jsou to při běžném makroskopickém měření skutečně sekundy.

Zmínil jste i zmenšení velikosti vzorků, které lze měřit. — To je extrémně důležité. Posun od vzorků o rozměrech v řádu milimetrů a centimetrů k tomu, že dnes jsme schopni analyzovat plošku desetkrát deset nanometrů. Jasně, v tom případě se nebavíme o malých přenosných přístrojích, ale velikost takové aparatury je srovnatelná s tou, která před lety sloužila k jednoduchému makroskopickému měření. Nekoherentní záření z výbojky stačilo řádově na centimetry, lasery nás posunuly k mikrometrům a po roce 2000 jsme se u hrotem zesílených spekter dostali k desítkám nanometrů.

Jaké výhody měření v řádu nanometrů přináší? — Umožňuje nám to sledovat jednotlivé větší molekuly nebo růst tenkých filmů s tloušťkou jednotek až desítek nanometrů. Uplatňuje se to například v materiálovém výzkumu. Ve spolupráci s kolegy z Ústavu makromolekulární chemie AV ČR studujeme tvorbu polymerní vrstvy na pevném povrchu, například elektrody. Můžeme sledovat homogenitu – jestli se jedná o kontinuální film, nebo se v něm objevují nějaké agregáty o rozměrech v řádu desítek nanometrů. Takto detailní informace jsou užitečné, pokud nám jde například o tvorbu povrchové vrstvy sloužící jako ochrana proti korozi, jako element pro molekulární rozpoznávání, jako katalytický povrch… Kromě toho se věnujeme i vzorkům biologického původu, konkrétně v souvislosti s kůží.

O co konkrétně jde? — Sledujeme uspořádání ceramidů⁵⁾ modelově v prasečí pokožce. Má to význam obecně pro studium možnosti průniku léčiv jednotlivými vrstvami kůže, pro interakci povrchu těla s nanočásticemi. Zajímá nás například možnost lokálního antibakteriálního působení stříbra při hojení ran. Lze to sledovat i makroskopicky, ale vhled na mikro- a nanoúrovni nám dává mnohem detailnější informace o mechanismech, které v tom komplexním systému fungují.

Osobně vás zajímají spíše konkrétní aplikace, nebo teoretické principy a vývoj nových metod? — Především ta metodická část. Má to kořeny v mládí. V osmdesátých letech se na matfyzu, kam jsem z Přírodovědecké fakulty docházel, budovala modulární laboratoř a člověk mohl vidět jednotlivé součásti celé sestavy: tady je laserový zdroj, tudy vede optická dráha, támhle je kyvetový prostor, za ním zpracování signálu… Podobně jsem měl možnost sestavit vlastní spektrometr po svém příchodu na VŠCHT v roce 1993. Bylo by rychlejší pořídit komerční přístroj, ale když si ho člověk sám sestaví, mnohem lépe mu rozumí. A může do něj doplňovat další komponenty, měnit jeho parametry, zkoušet nové postupy – což je jedna z rolí výzkumných pracovišť. Jistě, třeba organický chemik potřebuje spektrometrii čistě jako nástroj, k tomu jsou určeny komerční přístroje. Ale pokud chci metody rozvíjet, neobejdu se bez možnosti do přístroje zasahovat.

Přeskočme na závěr od spektroskopie k vaší rektorské roli. Připravuje se novela vysokoškolského zákona, vy na ní kritizujete úpravu stipendií pro doktorandy. Proč? — Stát chce doktorandům garantovat výrazně vyšší základní stipendium, což může vést k radikálnímu snížení počtu doktorandů, protože na ně školy nebudou mít.

Ale nezaslouží si doktorandi více peněz? — Bezesporu zaslouží, ale nemyslím si, že by základní stipendium mělo být jejich jediným příjmem. Sice se z něj neodvádějí daně ani zálohy na sociální a zdravotní pojištění, v tomto smyslu je výhodné, ale doktorand je na hranici mezi studentem a mladým výzkumníkem. Je podle mne žádoucí, aby nebyl závislý jen na stipendiu, byť jistě vyšším než dnes. Asi u tří čtvrtin doktorandů na VŠCHT to tak funguje, protože mají na škole částečný úvazek nebo dohodu o pracovní činnosti, podílejí se na projektech a jsou placeni z badatelských grantů. Fungují tu fakultní stipendia pro ty nejlepší, celoškolní prestižní Votočkova stipendia, takže celkový příjem většiny doktorandů je výrazně vyšší než ten, který jim garantuje základní stipendium. Myslím, že i do budoucna by se příjem doktorandů měl skládat z více zdrojů včetně částečného pracovního úvazku.

Nebylo by jedno stipendium jednodušší? — Jsem přesvědčen, že doktorandi by měli být i skrze odměňování zapojeni do aktivit školy. Lépe je to připraví na jejich budoucí kariéru. Roli hrají i motivační nástroje. Je podle mne v pořádku, že všichni doktorandi nemají stejné peníze. Lepší výkon je třeba ocenit. Navíc je třeba vidět celoživotní perspektivu a další výhody zaměstnaneckého poměru jak pro doktoranda, tak pro školu. 

Jak je to s podílem doktorandů na výuce? — To je další z připravovaných změn. Ministerstvo chce omezit povinnost doktorandů učit. Můj postoj je jiný. Jsem přesvědčen, že se člověk tím, že učí, sám hrozně moc naučí. Nechci samozřejmě z doktorandů dělat otroky učení. Nechci, aby denně trávili několik hodin výukou bakalářů. Ale do pedagogické práce spadá třeba i to, že jste konzultantem bakalářky nebo diplomky. Takže nějaké rozumné penzum pedagogických aktivit by mělo zůstat samozřejmou součástí doktorandských povinností.