Jak odstranit běžné potíže při fotometrickém stanovení koncentrace a čistoty biomolekul

V minulém čísle jsem popsala několik jednoduchých tipů jak pomocí pochopení toho co měřím a zákona Lamberta a Beera (viz. obr. 1) dosáhnout spolehlivých výsledků při stanovení koncentrací a čistoty biomolekul. Níže v textu najdete, jak absorbanci a koncentraci ovlivňuje rozměr kyvety a také, jaký by měl být správný přístup k měření velmi nízkých či velmi vysokých koncentrací biomolekul.

Jak lze tedy s rozměrem kyvety pracovat v rámci Lambert-Beerova zákona a jak se to projevuje prakticky? Konvenční kyvety s pracovním objemem na úrovni kolem 3 ml mají rozměr 1 cm. Tlak na použití co nejmenšího množství vzorku pro určení koncentrace a čistoty vedl ke zmenšování rozměru kyvet a obecně ke zmenšení množství vzorku. Existují tedy kyvety pro desítky μl (např. viz. obr. 2 Eppendorf UVette od 70 μl, rozměr kyvety pro průchod paprsku 1 cm a 0,2 cm), až jednotky mikrolitrů (např. obr. 3 Eppendorf μCuvette G1.0, rozměr kyvety pro průchod paprsku 0,1 cm).

V některých případech je zmenšení kyvety přímo žádoucí. Podívejme se na situaci znázorněnou na obr. 4. V 1 cm kyvetě je natolik koncentrovaný vzorek, že se jím k detektoru nedostává dostatek světla na spolehlivé určení výsledku. Jednou z možností, jak dosáhnout spolehlivého měření, je vzorek naředit a ředit ho tak dlouho, až se hodnota absorbance dostane do oboru spolehlivých čísel. Další a jednodušší možností je kratší průchod paprsku měřeným vzorkem – tedy méně molekul, které absorbují světlo a tedy kyveta s menším číslem I (na obr. č. 4 l = 1 mm).

Vezměme si to ale také obráceně, a to je bohužel naprosto nejčastější chyba, které se uživatelé dopouštějí. Jaká je situace na opačném konci, tedy u vzorků s nízkými koncentracemi? Když mám v jednocentimetrové kyvetě vzorek, s malým množstvím molekul, je hodnota absorbance nízká na to, aby bylo možné spolehlivě určit koncentraci. Nejčastější situace, která nastává v laboratoři je, že mám málo vzorku s nízkou koncentrací. Zdá se, že logické řešení je, vzít na měření mikrokyvetu. Co se ale stane?

Dám-li do cesty světlu ještě méně molekul, prostě nemohu dostat žádný spolehlivý výsledek. Uživatelé většinou cítí, že to není úplně ono, a nejsou si jisti a začnou v tomto případě vzorek měřit opakovaně. A pak jsou zmatení. Přestávají věřit přístroji i metodě samé, protože dostávají naprosto odlišné výsledky, které se neliší řádově, ale liší se mnohdy i o stovky procent (například 12 ng/μl a 25ng/μl). Zde nastupuje znovu to, co jsem již zmínila, „vím, co měřím“. Je potřeba alespoň tušit, zda je koncentrace vzorku velmi nízká, jsou-li ve vzorku velké nebo naopak malé molekuly, v jakém roztoku měřím (a tedy v jaké kondici mé molekuly jsou). Nesmím zapomenout na pohyb, který se odehrává ve vzorku i bez vnějšího míchání. A teď si to zase pro zjednodušení představme.

Při jednom měření se do cesty paprsku dostane jedna molekula mé pracně vyizolované vzácné vysokomolekulární DNA a výsledkem je, řekněme, slušná koncentrace, protože se molekula zrovna „správně“ zkroutila. Při dalším měření o 30 s později se stejná molekula stihla pohnout natolik, že ji paprsek mine a výsledná koncentrace je nulová. Toto je tedy naprosto jasně špatný přístup.

Jak tedy na měření nízkých koncentrací?

Použít 1 cm kyvetu, a pokud to nejde, pak je vhodnější použít na stanovení koncentrace biomolekul měření přes fluorescenční barvičky, než přímé měření. Na trhu existují komerčně dostupné jednoduché kity, které umožní stanovit, za pomoci vhodného přístroje, koncentrace od řádu pg/μl. Přístroj Eppendorf Bio- Spectrometer fluorescence (obr. 5) nabízí v jednom přístroji možnost měření absorbance při jednotlivých vlnových délkách, skenování přes spektrum vlnových délek a měření fluorescence vhodné pro určování velmi nízkých koncentrací biomolekul. Pomocí jednoho přístroje v kombinaci s mikrokyvetou je tak možné pokrýt rozsah koncentrací např. u dsDNA od jednotek pg/μl až do 1500 ng/μl, při dodržení hranice maximální absorbance A=3.

Zaujaly Vás tyto jednoduché typy z oblasti praktických přístupů ke stanovené koncentrací a čistoty biomolekul? Více se můžete dozvědět na semináři, na který je možno se přihlásit na webových stránkách www.eppendorf.cz