Vakcíny pěstované v rostlinách

Vakcinace (očkování) proti infekčním nemocem je efektivní prostředek ochrany zdraví. Současné klasické vakcíny jsou založeny na použití oslabených nebo mrtvých patogenů, což může nést riziko zvratu oslabeného patogenu do agresivní formy. V poslední době se začínají stále více uplatňovat podjednotkové vakcíny, které obsahují jeden nebo více antigenů (částí patogenů vyvolávajících obrannou reakci) nebo proteinů odvozených od patogenů. Antigeny užívané v těchto vakcínách se připravují v savčích a hmyzích buněčných kulturách (popřípadě v kvasinkách) podle jejich schopnosti vytvořit požadovaný protein podobným způsobem, jako to dělá přirozený organismus, od nějž je antigen odvozen. Nevýhodou tohoto postupu jsou drahá média používaná pro kultivaci buněk a nákladný čisticí proces, kterým se vakcíny z buněčných kultur získávají. Většina podjednotkových vakcín získaných v těchto systémech je tepelně nestálá, vyžaduje chlazení nejen při čištění, ale i při skladování a musí být aplikována injekčně. Všechny uvedené požadavky přesahují možnosti špatně financovaných zdravotnických systémů především v rozvojových zemích.

Slibnou alternativou k zmíněným postupům je příprava vakcín v rostlinách. Velkou výhodou tohoto způsobu je, že nedochází ke kontaminaci vakcín savčími toxiny a patogeny. Používá se podávání ústy (orální imunizace), což zjednoduší a zlevní imunizační programy.

Počet různých rostlin a vektorů odvozených od rostlinných virů používaných pro přípravu vakcín se za posledních 15 let velmi rozšířil. Také seznam produkovaných experimentálních vakcín zahrnuje mnoho antigenů odvozených od virů, bakterií i autoimunních antigenů. Vakcíny produkované v rostlinách jsou schopné zabránit propuknutí nemoci u zvířecích modelů a některé z nich jsou již ve stadiu klinických testů pro nasazení u lidí. Avšak plnému využití potenciálu této nové technologie brání především nedostatečné znalosti o navození mukózní (slizniční) imunity, chybí znalosti, jak zvýšit schopnost vyvolat obrannou reakci u slizničně podávaných podjednotkových vakcín, a je nutný další výzkum týkající se stability antigenu při imunizaci i během jeho přípravy v rostlinách.

Orální imunizace

Povrchy mukózních sliznic jsou nejdůležitějšími místy vstupu savčích patogenů, zvláště bakterií a virů.¹⁾ Ačkoli je tradiční injekční vakcinace účinná u mnoha nemocí, je méně efektivní u nemocí dýchacích cest a střevních infekcí. Vysvětluje se to tím, že systémová vakcinace je špatným induktorem mukózní imunity, a proto může patogen kolonizovat organismus dříve, než systémová imunita zpomalí či zabrání infekci. Imunizace prostřednictvím mukózní sliznice má dále výhodu v tom, že nejsou potřeba injekční stříkačky a jehly, imunizace rostlinami navíc chrání produkované antigeny buněčnou stěnou před kyselým prostředím žaludku.

Rostlinné produkční systémy

Na výběr rostlinného produkčního systému lze uplatnit různá kritéria. Rozhodnutí je složité v tom, že každý systém má pro určitý produkt svoje výhody a nevýhody. Nejčastěji se používají tři systémy – buněčné či tkáňové kultury a celé rostliny. Všechny rostlinné produkční systémy vykazují posttranslační modifikace (připojení dalších nebílkovinných složek na protein), což je důležité pro vyvolání imunitní reakce produkované rekombinantními proteiny.²⁾

Použijí-li se celé rostliny, můžeme v nich připravit antigeny buď transientní (dočasnou) expresí při použití vektorů odvozených od rostlinných virů, nebo permanentní (trvalou) transformací z transgenních rostlin. Produkce vakcín v celých rostlinách je nenáročná na primární vstupy (světlo, živiny, voda), umožňuje jednoduché a rychlé zvýšení produkce v závislosti na poptávce zvětšením pěstební plochy a většinou jsou vypracované jednoduché postupy sklizně a zpracování vakcín. Nevýhodou použití celých rostlin je u transgenních rostlin dlouhý proces výběru linie s požadovanými vlastnostmi.³⁾ Velkým problémem je také kontrola bezpečnosti použití transgenních rostlin z hlediska úniku transgenu do okolí a možná kontaminace potravního řetězce. Toto riziko je daleko menší při použití dočasné exprese pomocí nové generace rostlinných virových vektorů.⁴⁾ Tím se minimalizuje možnost samovolného úniku do okolního prostředí, kdy bezpečnost je znásobena ještě dále jejich použitím v uzavřených sklenících.

Špatná imunogenita orálně podávaných podjednotkových vakcín

Široké aplikaci vakcín produkovaných v rostlinách brání hlavně špatná odpověď savčího imunitního systému na takto připravené podjednotkové vakcíny. Používají se proto nosné proteiny,⁵⁾ které zvyšují schopnost rostlinných vakcín vyvolat imunitní reakci (imunogenitu) tím, že ruší toleranci vůči společně podávanému antigenu.

Dalším problémem je variabilita produkce podávaných dávek při expresi rekombinantních proteinů v transgenních rostlinách. Ta je daná různým začleněním genu pro cizorodý protein do genomu rostliny (poziční efekt). Takto vložený gen se může svým účinkem v různé míře projevit ve více než jednom znaku organismu (jde o pleiotropní efekt). Variabilita ztěžuje kontrolu přesné podávané dávky v rostlinných vakcínách a produkované množství je často nízké. Částečně lze vakcínu koncentrovat a stabilizovat zpracováním rostlinného materiálu, např. vymrazováním vody za sníženého tlaku (lyofilizací).

Zvýšení koncentrace antigenu lze také dosáhnout dočasnou produkcí (expresí) antigenů pomocí virových vektorů. Virus parazituje v rostlinné buňce a množením svých genů množí i vložený cizorodý gen, to vše ve velmikrátkém časovém úseku. Nevýhodou tohoto přístupu je, že se rostliny musí individuálně rekombinantním virem infikovat.

Některé viry jsou schopné tvořit viru podobné částice (VLPs – virus like particles), které obsahují pouze bílkovinný kapsidový (obalový) protein, a nikoli nukleovou kyselinu nesoucí genetickou informaci pro jejich množení. Tyto VLPs si zachovávají klíčové imunologické rysy virů a mohou být vyráběny v rostlinných systémech produkujících cizorodé proteiny ve velkém množství. VLPs tak reprezentují další bezpečnou a efektivní vakcinační platformu.

Bezpečnost vakcín připravovaných v rostlinách

Vakcíny připravované v rostlinách jsou podrobovány týmž, ne-li přísnějším kritériím kontroly kvality a bezpečnosti, jako je tomu u vakcín připravovaných v bakteriích, kvasinkách či jiných systémech.

Jedním z kritérií bezpečnosti při produkci antigenů v rostlinách je ochrana potravního řetězce před kontaminací famaceuticky aktivními proteiny. Kontaminace by mohla např. nastat, kdyby pyl z transgenních rostlin opylil rostliny určené k produkci potravin. Nebo kdyby zařízení ke sklizni či zpracování rostlin produkujících vakcíny bylo použito bez dekontaminace pro rostliny pěstované pro potravinařské účely. Kontrola je založena na striktních pravidlech obsahujících geografickou izolaci, nárazníkové rostliny a přísná pravidla kontroly ve skleníku. Pokud ke kontaminaci dojde, plodina musí být zničena.

V naší laboratoři se zabýváme oběma přístupy k vývoji podjednotkových vakcín „pěstovaných“ v rostlinách. Ve spolupráci s Ústavem  hematologie a krevní transfuze v Praze se zabýváme základním výzkumem transientní exprese experimentálních profylaktických (ochranných) a terapeutických (léčebných) vakcín proti antigenům odvozeným z lidského papilomaviru typu 16 (HPV16), jehož infekce je dávána do souvislosti především s rakovinou děložního čípku u žen. Optimalizujeme podmínky pro zvýšení exprese vakcíny – např. umístěním antigenu ve virovém rostlinném vektoru, výběrem vhodných bylinných hostitelů a vývojem nových dekonstruovaných virových vektorů. Pro trvalou expresi vyvíjíme systém založený na produkci vakcín v semenech luštěnin.

Přes výše zmíněné nedostatky je produkce vakcín v rostlinách slibnou technologií, kterou by mohly být připraveny levné, bezpečné a orálně podávané vakcíny, jež by našly uplatnění v boji proti infekčním chorobám hlavně v rozvojových zemích.