Inzulin a historie vědy

Z příspěvku Vladimíra Plišky (Vesmír 88, 700, 2009/11) se dovídáme, jak inzulin provázely mnohé peripetie vědy i vědců. Ty však neskončily v polovině 20. století. Tento slavný peptid stál i u vzniku moderní biotechnologie – techniky rekombinantní DNA nazývané transgenoze.

Druhé jednání dramatu

Druhé jednání jeho dramatu začíná 24. května 1976 v Indianopolis. Firma Eli Lilly & Co (o které jsme se dověděli v uvedeném článku, že od roku 1922 inzulin vyráběla) svolala několik molekulárních biologů a předložila projekt připravit metodou genového inženýrství lidský inzulin. Ten se totiž liší od běžně používaného prasečího v jedné z jednapadesáti aminokyselin a citliví pacienti na to reagují (viz článek Oldřicha Lapčíka, Vesmír 88, 704, 2009/11). Výzvu přijaly tři skupiny: z Harvardovy univerzity tým Waltera Gilberta, z Kalifornské univerzity v San Francisku skupina Herberta Boyera, se kterou spolupracoval Arthur Riggs z City of Hope (později firma Genentech) a tým Williama Ruttera s Howardem Goodmanem.

Klasický postup předepisuje izolovat z lidských β-buněk Langerhansových ostrůvků mRNA, která nese kód pro peptidy inzulinu, a podle ní pak reverzní transkriptázou připravit kopii DNA odpovídající lidskému genu pro inzulin. Pomocí Boyerových restriktáz vložit do Cohenova bakteriálního plazmidu a vpravit ho do bakterie. Ta bude při troše štěstí syntetizovat lidský inzulin. To byl postup, který zvolil Walter Gilbert, a vydala se tímto směrem i Boyerova skupina na Kalifornské univerzitě. Dva mladí „postdoci“ Boyerovy laboratoře – F. Bolivar a R. L. Rodriguez – nad pivem v místní hospodě vymysleli a pak v laboratoři zkonstruovali velmi rafinovaný plazmid, podle nich označovaný pBR322, a Axel Ullrich ze skupiny Ruttera a Goodmana do něj vložil potkaní gen pro inzulin, připravený výše popsaným postupem. Vnesli ho v únoru 1977 úspěšně do genomu Escherichia coli. To byl významný mezník biotechnologie – bylo to první vnesení savčího genu do bakterie.

Úředníci a politici

Jenže pak nastoupili úředníci. V USA tehdy musely být vektory schváleny Poradním výborem pro rekombinantní DNA (RAC). Jeho ředitel William Gartland však prvého března na zasedání výboru zdůraznil, že plazmid pBR322 je sice schválen, ale ne certifikován ředitelem NIH (Federálního zdravotního ústavu), tudíž je klonování savčích genů pomocí tohoto vektoru ilegální. Milník biotechnologie tedy disciplinovaně skončil 19. března 1977 v nádobě s ředěnou kyselinou chlorovodíkovou (HCl).

Politici nezůstali pozadu. Senátor Adlai Stevenson III. z Illinois chtěl na této kauze demonstrovat svou péči o bezpečnost voličů. Povolal Williama Ruttera a Herba Boyera před kongresový výbor pro vědu, technologie a vesmír. Celá současná biologie se octla na lavici obžalovaných 8. listopadu 1977. Předcházela ponižující kontrola speciálně zabezpečené P3 (laboratoře, kde se smějí přenášet geny) včetně zpětné revize protokolů. (Nepřipomíná vám to něco z EU o 30 let později?)

Exprese vloženého savčího genu v bakterii

Z této historie se poučil tým Harvardovy univerzity. Lidia Villa-Komaroff využila již povolený plazmid pBR322 a na prvního máje 1978 získala z E. coli fúzní protein, v němž byla spojena penicilináza (produkt selekčního genu) a potkaní inzulin. To byl další milník historie: exprese vloženého savčího genu v bakterii. Zbývalo jen nahradit potkana člověkem. Jenže podle předpisů se s lidským genem smělo pracovat pouze v laboratoři P4 (nejvyšší bezpečnostní třídy), a tu měla v USA jen armáda ve Fort Detricku k výzkumu biologických zbraní. Pustit tam civila bylo nepředstavitelné. Angličané byli vstřícnější: ředitel Vojenského výzkumného mikrobiologického zařízení Robert Harris souhlasil, že po dobu čtyř týdnů smí skupina Gilberta využít vojenskou laboratoř v Portonu. 1. září 1978 nastalo velké stěhování harvardských vědců do staré dobré Anglie.

Krušně se přizpůsobivše vojenským předpisům prováděli hosté totéž co Lidia Villa- Komaroff, ale s lidskou mRNA. Získanou bakteriální DNA sekvenoval Argiris Efstratiadis, který oznámil katastrofu: gen sice odpovídal molekule inzulinu, ale potkaního! Zřejmě z posledního pokusu prováděného na Harvardu zůstaly některé pomůcky kontaminované potkaní nukleovou kyselinou. Povolený pobyt končil a veškerá námaha byla marná.

Moderní průmyslová biotechnologie na světě

Osud rozdává náhody takové i makové. Gilbert dostal červenou. Kalifornská skupina, která mezitím založila firmu Genentech, dostala zelenou. V roce 1974 Art Riggs v City of Hope dostal dopis od sebevědomého mladíka. Dvaatřicetiletý Japonec Keiichi Itakura prohlašoval, že je v chemické syntéze polynukleotidů, tj. řetězců nukleových kyselin, desetkrát rychlejší než nositel Nobelovy ceny Har Gobind Khorana. Historické rozhodnutí Riggse hnulo dějinami biotechnologie: „Bereme ho!“

Itakura se planě nevychloubal: na třetí pokus připravil perfektní řetězce DNA. To byl v té době výkon! Inzulin se skládá ze dvou řetězců o třiceti a jednadvaceti aminokyselinách, což při tripletovém kódu znamená 90 a 63 nukleotidů v řetězci (kromě zaváděcích úseků). Tento produkt měl kromě toho obrovské kouzlo: ačkoli byl identický s lidským genem pro inzulin, pro byrokraty to byla chemikálie a žádné restrikce (laboratoř P4 apod.) se na něj nevztahovaly. Takže Dennis Kleid a David Goeddel ve starém skladišti zakrytém střechou z plastové fólie v noci z 23. na 24. srpna 1978, tedy v době, kdy Gilbertův tým balil do Portonu, získali z bakteriální kultury asi 20 ng lidského inzulinu vyrobeného genovým inženýrstvím. Moderní průmyslová biotechnologie byla na světě.

Ekonomická paralela

Drama inzulinu má kromě vědy i ekonomickou paralelu. Techniku vkládání genů pomocí restriktáz nabízel Herbert Boyer už v roce 1975 různým firmám, ale bez úspěchu. V té době Robert Swanson, který získal bakalářskou hodnost v biochemii na Massachusettské technice a pracoval ve firmě poskytující rizikový kapitál, považoval technologii rekombinantní DNA za perspektivní. Nabízel k jejímu využití finance různým společnostem i vědcům včetně Paula Berga, ale nepochodil. Až v lednu 1976 zavolal Boyerovi, navštívil ho v laboratoři a následně v nedalekém baru oba zjistili, že mají stejný názor: měla by se založit firma, která by komerčně využívala rekombinantní DNA technologii. Učinili tak každý vložením 500 amerických dolarů (Boyer si je prý musel půjčit) a firmu nazvali Genentech.

Dne 14. října 1980 burza na Wall Street dala po otevření do prodeje 1,1 milionu akcií Genentech po 35 amerických dolarech. Za 20 minut byla jejich cena 89 a večer uzavírala na 71,25. Boyer a Swanson získali po 66 milionech amerických dolarů. To byl start boomu biotechnologického průmyslu. Biotechnologické firmy vyrůstaly jak houby po dešti, některé sice žily krátce, ale mnohým se dařilo. Jednou z nich byla firma Biogen, kterou založila skupina investorů a Walter Gilbert 6. května 1978 jako konkurenci ke Genentech. Biogen se později zapsal do historie přípravou lidského růstového hormonu.

Tak sice Boyer nedostal Nobelovu cenu jako Walter Gilbert (1980 spolu s Paulem Bergem a Frederickem Sangerem za sekvenování), ale stal se nejbohatším molekulárním biologem.