Aktuální číslo:

Jak se loví geny v Sargasovém moři

aneb S brokovnicí na mořské mikroorganizmy

| 16. 2. 2006

| Vesmír 85, 95, 2006/2

Díky povídkám Oty Pavla zná většina Čechů Sargasové moře jako oblast, kde se tře náš úhoř říční. Někdo si možná vzpomene na hnědé chaluhy rodu Sargassum, podle nichž moře pojmenovali Kolumbovi námořníci. Málokdo však tuší, že je toto moře jednou z nejstudovanějších oblastí světového oceánu, která přitahuje pozornost oceánografů již téměř sto let. Voda Sargasového moře je údajně „nejmodřejší“ na světě. Pozorovaná průhlednost je zde až 60 m (pro srovnání: v mnohých jihočeských rybnících je to pár desítek centimetrů), což je způsobeno extrémním nedostatkem základních živin (dusíku a fosforu) v povrchové vrstvě vody. Proto zde výrazně nenarůstají řasy a sinice (fytoplankton) ani na ně navazující heterotrofní organizmy. Pásma kolem 30° zeměpisné šířky patří mezi velice chudé oblasti oceánu obecně. Středověcí námořníci se těchto oblastí obávali, neboť stálé tlakové výše a dlouhotrvající bezvětří je často upoutávaly na místě a minimum srážek pak na lodích způsobovalo krutý nedostatek vody. Bezvětří, které děsilo námořníky, brání i přísunu základních živin z větších hloubek na povrch, kde je jich pro růst fytoplanktonu třeba.

Přestože oceánské oblasti chudé na živiny (oligotrofní) pokrývají téměř polovinu zemského povrchu, o mikroorganizmech obývajících tyto oblasti máme dosud pouze kusé informace. Je to způsobeno jednak tím, že jsou v běžném optickém mikroskopu téměř neviditelné, a také tím, že většinu z nich nejsme zatím schopni pěstovat v laboratoři (viz Vesmír 82, 396, 2003/7). Standardní mikrobiologické kultivační postupy selhávají, z tisíce bakterií přítomných v kapénce mořské vody nejsme v laboratoři často schopni kultivovat ani jedinou. Z této téměř bezvýchodné situace nám v poslední době začíná pomáhat molekulární biologie. Molekulární biolog studující mořské planktonní populace obvykle odebere a přečistí vzorek DNA z mořské vody, a pak jej použije ke studiu v laboratoři. Protože takový vzorek představuje směs mnoha druhů či genotypů, nejčastěji se analyzují pouze některé všudypřítomné a dostatečně konzervované geny (zpravidla gen pro ribozomální RNA). Obvykle se na základě několika desítek sekvencí usuzuje na skladbu mořské mikrobiální komunity. Ačkoli tak lze získat jen střípky z mozaiky, vedl tento postup v minulosti k význačným objevům a odhalil dosud netušené skupiny mořských mikroorganizmů (viz Vesmír 82, 396, 2003 a 81, 505, 2002).

Obrat v tomto pomalém a pracném postupu přišel z nečekané strany. Když Craig Venter (viz rámeček 1 ) ukončil práci na sekvencování lidského genomu a odešel z Celery Genomics, mohl si poklidně užívat pohodlí své vily na Bermudách. Jeho nadšení pro molekulární genomiku a vášeň pro moře se ale spojily v dalším ambiciózním projektu. Rozhodl se sekvencovat mikrobiální komunitu nacházející se ve vodách Sargasového moře v rozsahu rovnajícím se sekvencování lidského genomu. Pro odběry vzorků použil svou soukromou jachtu Sorcerer II, kterou přeměnil v plovoucí laboratoř. Z celkem 1500 odebraných litrů mořské vody byla izolována směsná DNA a tou byla posléze „nakrmena“ armáda sekvenátorů Venterova soukromého Science Foundations Joint Technology Center v marylandském Rockvillu. Na rozdíl od postupného sekvencování jednotlivých genů byla získaná DNA sekvencována zcela náhodně metodou shotgun (viz rámeček 2 ). Po osekvencování dvou milionů fragmentů DNA nastoupila důležitá zbraň – strategie shotgun. Jde o počítačový program, jehož úkolem bylo sestavit z jednotlivých útržků genů větší celky. Tento program, vyvinutý původně pro účely sekvencování lidského genomu, musel být upraven tak, aby byl schopen zpracovávat sekvence ze směsné populace.

Po zpracování všech dat program vygeneroval více než jednu gigabázi genetického kódu (pro představu: běžný bakteriální genom má velikost kolem 2 až 3 megabází, eukaryonta mohou mít genomy 30 až 2000 megabází a genom člověka má přes 3 gigabáze). Získané výsledky jsou překvapivé. Dokládají totiž dosud netušenou genetickou rozmanitost oligotrofních oblastí. Mikrobiální populace je zde podle odhadu tvořena minimálně 1800 druhy. Podařilo se popsat sekvence více než milionu nových genů a sestavit dva téměř kompletní prokaryontní genomy. Jedním z nich je genom oxychlorobakterie Prochlorococcus. Tento blízký příbuzný sinic je typickým obyvatelem teplých oligotrofních oceánů a je odpovědný za velkou část fotosyntetické produkce v těchto oblastech. Celá databáze je volně přístupná na internetu.

Přestože Venterovo zpracování vzorků DNA pravděpodobně provázely problémy s kontaminací (v získaných sekvencích byla identifikována půdní bakterie Burkholderia), stala se tato práce přelomem v analýze mikrobiálních populací a vědci budou z jejích výsledků těžit řadu let. Porozumění mořskýmmikroorganizmům je totiž důležité pro pochopení života vůbec, neboť právě ony byly prvními průkopníky života na naší planetě. Proto lze s jistotou tvrdit, že podobných genetických projektů bude přibývat. Sám Venter pokračuje na své jachtě v cestě kolem světa a odebírá vzorky pro molekulární analýzu dalších mořských ekosystémů. Též americká Moorova nadace, která se na Venterově projektu finančně podílela, chce v práci na sekvenaci mořských mikroorganizmů pokračovat. Loni se rozhodla finančně podpořit sekvencování několika desítek mořských mikroorganizmů dostupných v čisté kultuře. Na projektu se podílejí i Ústav fyzikální biologie v Nových Hradech a Laboratoř fotosyntézy Mikrobiologického ústavu v Třeboni, která uchovává unikátní sbírku mořských fototrof ních bakterií. První výsledky by měly být k dispozici již letos. Jejich analýza bude bezpochyby velmi zajímavá už jen s ohledem na možnost využití Venterovy rozsáhlé databáze genů mořských mikroorganizmů.

Literatura

J. C. Venter a kol.: Environmental Genome Shotgun Sequencing of the Sargasso Sea, Science 304, 66–74, 2004
P. G. Falkowski, C. de Vargas: Shotgun Sequencing in the Sea: A Blast from the Past?, Science 304, 58–60, 2004
P. G. Falkowski a kol.: The Evolution of Modern Eukaryotic Phytoplankton, Science 305, 354–360, 2004
www.sorcerer2expedition.org/main.htm >

Je jedním z nejznámějších, nejkontroverznějších a určitě nejbohatších vědců současnosti. V mládí se sice zajímal mnohem více o surfování než o školu, ale otřesné zážitky, které si přinesl z války ve Vietnamu, ho změnily. Vrhl se na studium a získal doktorát z farmakologie a fyziologie na Kalifornské univerzitě. V druhé polovině osmdesátých let začal jako jeden z prvních využívat automatické sekvencování. Podařilo se mu získat sekvence tisíců lidských genů a jeho jméno začalo být spojováno s pokusy tyto sekvence patentovat. V roce 1992 opustil akademickou sféru a stal se šéfem soukromého „neziskového“ ústavu pro výzkum genomu (TIGR), z něhož postupně vybudoval největší sekvenační laboratoř na světě. Velmi rychle se mu podařilo vydělat miliony dolarů na prodeji sekvencí lidských genů farmaceutickým firmám, za což si vysloužil ostrou kritiku vědců z celého světa. V roce 1993 zaměstnal Hamiltona Smithe, laureáta Nobelovy ceny za objev restrikčních enzymů, který navrhl nový přístup k sekvencování, metodu shotgun (viz rámeček ). O dva roky později byl pomocí tohoto přístupu přečten genom bakterie Haemophilus influenzae, první kompletní sekvence živého organizmu vůbec. V roce 1998 založil Venter firmu Celera Genomics s cílem získat kompletní sekvenci lidského genomu. Aby se zjistilo, zda je metoda shotgun vhodná i pro velké genomy, byla vyzkoušena na octomilce (Drosophila melanogaster). Kompletní genom tohoto základního modelového organizmu byl osekvencován během pouhého roku. Na vrcholu slávy se Venter ocitl v roce 2000, kdy byla v časopise Science publikována sekvence lidského genomu z jeho laboratoří. Ve stejné době byla zveřejněna také sekvence placená z veřejných zdrojů, ale Venterova soukromá firma odvedla stejnou práci rychleji a výrazně levněji. O dva roky později byl Venter překvapivě z Celera Genomics propuštěn. Pokračuje však ve své práci, zakládá tři nové nadace a plní si svůj dávný sen – plaví se na své jachtě Sorcerer II kolem světa a cestou odebírá vzorky DNA určené k sekvencování. Jistě není náhodou, že zvolená trasa nápadně připomíná slavnou Darwinovu plavbu na HMS Beagle.

METODA SHOTGUN

Sekvencování DNA metodou shotgun (což je v doslovném překladu brokovnice) lze s trochou nadsázky přirovnat k luštění šifry hrubou silou. Většinu práce v obou případech odvedou stroje a počítače – o tom, kolik času bude třeba k rozluštění, rozhoduje jen jejich výkon. Namáhat si mozek není nutné (genomové odborníky prosíme za prominutí).

Řetězec DNA je tvořen posloupností čtyř základních písmen (bází), jejichž pořadí se sekvencováním snažíme určit. Zdálo by se přirozené číst tento řetězec postupně, od jednoho konce k druhému, a krátké kousky DNA se tak skutečně sekvencují. Složitější situace nastává u delších řetězců DNA. V jedné sekvenační reakci lze totiž přečíst pouze omezené množství (několik set) bází. Postup je zpravidla takový, že konec jednoho sekvencovaného úseku vždy použijeme jako místo pro začátek další sekvenační reakce. Ze série překrývajících se fragmentů nakonec sestavíme souvislý řetězec DNA (obrázek 3). Sekvencovat takto několik tisíc bází je běžné, ale genomy bakterií jsou tvořeny miliony bází a u vyšších organizmů jsou to miliardy. Pro osekvenování tak ohromného počtu není popsaná strategie příliš účinná. Metoda shotgun však používá odlišný přístup (obrázek 4). DNA se v tomto případě nejprve „rozstříhá“ na menší kousky. Vzniklé fragmenty se vloží do bakteriálního plazmidu a pomnoží. Získané klony se sekvencují náhodně, padni kam padni; proto ta brokovnice v názvu metody. Po osekvencování dostatečného počtu fragmentů se již dostávají do hry počítače. Speciální program porovnává všechny získané útržky mezi sebou a identifikuje sekvence, které se shodují – překrývají. Na základě těchto překryvů se postupně rekonstruuje celý řetězec DNA. Při strategii shotgun převyšuje sice celkový počet osekvencovaných bází několikrát délku celkové DNA, při dnešním výkonu automatických sekvenátorů to však již nehraje tak důležitou roli.