Kinázy rodiny polo

Jakým způsobem je kontrolováno buněčné dělení a děje, které mu předcházejí? Tato otázka trápí biology už dlouho. Kdo dokáže říci, kolik životů by zachránila dokonalejší cytostatika? Jak by se změnily reprodukční biologie, medicína, biotechnologie a další obory, kdybychom dokonale poznali všechny hráče buněčného cyklu? Představíme vám alespoň některé, dnes již známé členy obrovské společnosti nitrobuněčných regulátorů, jež umožňují hojit rány a obnovovat tkáně, podílejí se na vzniku tkání a svými vzájemnými vztahy tvoří část tajemství života.

Odpověď na otázku vyslovenou v úvodu se začala rýsovat během rozvoje metod molekulární biologie, biochemie a cytologie ve 20. století. V sedmdesátých letech přinesly pokusy na kvasinkách, mořských hvězdicích a žábách drápatkách zajímavé zjištění – v jejich buňkách se během buněčného cyklu hromadí malý protein, jehož množství je nejvyšší během mitózy, potom je v mitotické anafázi úplně odbourán a od fáze G1 se opět začíná hromadit (viz Vesmír 84, 139, 2005/3). Tak se to děje stále dokola, cyklicky, a proto tento malý protein dostal název cyklin. Brzy se ukázalo, že cyklinů je více a že jejich hromadění v průběhu cyklu není samoúčelné. Cykliny působí jako regulační podjednotky kináz závislých na cyklinech, jež jsou základními regulátory buněčného cyklu. Podílejí se například na kondenzaci chromatinu, na „rozpouštění“ jaderné membrány a na řízení vstupu do S-fáze. Kontrolují replikaci DNA a nástup buněčného dělení.

Později se ukázalo, že existují i kinázy a fosfatázy nezávislé na cyklinech – a také ony mají důležitou úlohu v buněčném cyklu. Některé z nich aktivitu těch prvních kináz, které jsou na cyklinech závislé, podporují, jiné ji naopak brzdí, nebo ji dokonce dovedou zastavit a zabránit dalšímu postupu buněčného cyklu. Vztahy mezi těmito regulátory jsou zkrátka spletité. Všimněme si nyní alespoň jedné rodiny těchto nezávislých kináz, která dostala název polo.

Členové rodiny se představují

Kinázy rodiny polo (Polo-like kinases, Plk) mají důležitou úlohu v regulaci mitózy, meiózy i diferenciace, a to u rozdílných eukaryontních organizmů. Zřejmě jde o regulátory biologicky univerzální, neboť byly nalezeny u kvasinek, hmyzu, žab i savců včetně člověka a vykazují vysokou sekvenční podobnost.

Zpočátku jsme znali jen tři členy této rodiny. První byl identifikován koncem osmdesátých let minulého století u octomilky (Drosophila melanogaster), a to v mutaci polo, podle které pak byla rodina pojmenována. Zkoumaní mutanti vykazovali odchylky v mitóze i meióze. Pozorovány byly chybná segregace chromozomů, vady na mikrotubulárním aparátu na pólech dělicího vřeténka a poruchy buněčného dělení (cytokineze). Druhý člen rodiny byl objeven u kvasinky Saccharomyces cerevisiae, třetí pak u její příbuzné Schizosaccharomyces pombe. Později se přišlo na to, že zatímco organizmy jako kvasinka či octomilka mají jen jednu kinázu rodiny polo, buňky hlístice (Caenorhabditis elegans) a žáby drápatky (Xenopus laevis) disponují hned třemi.

Rodina se utěšeně rozrůstala a začátkem devadesátých let byli objeveni další její členové u savců. Svět polo-kináz u savců je ještě složitější. Dnes jsou známy čtyři polo-kinázové skupiny (Plk1–Plk4) a vypadá to na pořádně složitou síť jejich vzájemných vztahů.

Co rodinu spojuje a v čem se jednotlivci liší?

Hlavní charakteristikou všech kináz rodiny polo je přítomnost fylogeneticky velmi konzervativní aminokyselinové sekvence na C-konci molekuly, která obsahuje přibližně 30 aminokyselinových zbytků. Říká se jí polo-box. Většina polo-kináz (viz obrázek) má dva polo-boxy, které „se starají“ o předepsané rozmístění enzymů v buňce, a tím zajišťují jejich správnou funkci. Určitou výjimku tvoří savčí polo-kináza Plk4. Ta obsahuje pouze jeden polo-box, který má však stejnou funkci jako polo-boxy ostatních polo-kináz. Všechny kinázy rodiny polo mají také vysoce konzervovanou oblast na N-konci, kde se nalézá katalytická kinázová doména. Všechny společné funkce kináz rodiny polo zdaleka nejsou osvětleny. Přestože jsou všechny nějakým způsobem spojeny s mikrotubuly a „kostrou buňky“ (cytoskeletem), jedny umožňují správnou segregaci chromozomů a cytokinezi, druhé se podílejí na ději považovaném za opačný, tedy na diferenciaci. Všechny polo-kinázy též představují „druhou kolonu“ regulátorů kináz závislých na cyklinech, a to během celého buněčného cyklu. Obecně se však traduje, že kinázy rodiny polo jsou indikátory růstové aktivity buněk, protože měření exprese prvních objevených členů ukázalo vysokou hladinu mRNA i vlastních proteinů právě v množících se buňkách. Je to ale složitější. Podívejme se proto na jednotlivé polo-kinázy, které byly nalezeny u savců, poněkud podrobněji.

Čtyři savčí kinázy rodiny polo

• Průvodkyně dělením (Plk1) provází každou eukaryotickou buňku mitózou nebo meiózou. Upozorňuje na sebe na konci fáze G2, kdy buňce připravené nastoupit cestu buď k dalšímu životu, nebo k buněčné sebevraždě (apoptóze) pootevře těžkou bránu buněčného dělení. Není na to však sama. Stejně jako ve známé Hrubínově básničce si pozve svoje kamarády. Fosforylací přesune cyklin do jádra, aktivuje fosfatázy přímo ovlivňující kinázy závislé na cyklinech, a ty pak „rozpustí“ jadernou membránu a zorganizují chromatin. Zatímco cytolog žasne u mikroskopu nad velkými změnami, jež v buňce proběhly, Plk1 zatím v tichosti připravuje delikátní operaci – spravedlivé rozdělení genetického materiálu mezi buňky. V anafázi se setkává se svou sestřičkou Plk4, která je nezbytná pro odbourání cyklinu (viz dále), společně buňku vyvádějí z nástrah karyokineze a spoluorganizují rozdělení celé buňky – cytokinezi. Problém však nastává, když nejsou „poměry“ v buňce normální, neboť stálá exprese této kinázy vyvolává nádorové bujení. Proto se o tomto proteinu uvažuje jako o velice spolehlivém indikátoru zhoubného bujení a proliferační aktivity buněčné populace vůbec.
• Dozorkyně nad buněčnou diferenciací (Plk2) je přesný opak své sestry Plk1. Vyskytuje se v tkáních dospělých jedinců, které nejsou aktivní v množení buněk, proto ji můžeme nalézt například v mozku, kde reguluje funkci mikrotubulů v neuronech, ale nenajdeme ji ve varlatech ani v brzlíku. Nicméně i tato polo-kináza je nezbytná pro zdárný embryonální vývin a regulaci buněčného cyklu. Embryonální vývoj mutovaných myší, které zmíněnou kinázu vůbec neměly, byl výrazně opožděn. Navíc se ukázalo, že Plk2, jak je u těchto kináz zvykem, hraje důležitou roli i při tvorbě cytoskeletu buněk produkujících základní vazivovou hmotu (fibroblastů).
• Údržbářka dělicího vřeténka (Plk3) si vzala kousek od každé z předchozích dvou jmenovaných kináz. Je přítomna ve všech fázích buněčného cyklu. Její koncentrace je konstantní, její kinázová aktivita však prudce vzrůstá na konci fází S a G2. Podílí se hlavně na organizaci dělicího vřeténka, je nezbytná pro správnou migraci zdvojených centrozomů k pólům vřeténka. Význam této kinázy pro správnou dynamiku mikrotubulárního aparátu jednoznačně podtrhuje její lokalizace na mitotickém vřeténku. S funkcí cytoskeletu není ovšem spojena jen v průběhu buněčného dělení. Reguluje také polymerizaci, respektive depolymerizaci mikrotubulů při diferenciaci nervových buněk.
• Tajemná neznámá (Plk4). Posledním členem rodiny savčích polo-kináz je serin-treo ninová kináza, která obsahuje jen jeden polo-box a je zatím ze všech rodinných příslušníků nejméně srozumitelná. V důsledku alternativního sestřihu příslušné mRNA má tato polo-kináza dvě různé formy, přičemž první má dvojnásobnou molekulovou hmotnost oproti druhé a o její funkci není nic známo. Obě formy se vyskytují v embryonálních tkáních (v dospělých organizmech opět jen ve varlatech, ve kterých se ovšem díky velké proliferační aktivitě vyskytují téměř všechny proteiny spojené s regulací dělení). Na objasnění fyziologické funkce této kinázy si ještě počkáme. Zatím se o ní ví jen to, že je nezbytná pro destrukci cyklinu B1 prostřednictvím proteolytické funkce proteazomu v myších embryích, která dokončila gastrulaci. Zde je nutná pro správnou organizaci embryonálních tkání. Vývoj embryí se u pokusných myší s inaktivovaným genem zastavil ve stadiu gastruly. V embryích byla prokázána přítomnost velkého množství buněk hynoucích buněčnou smrtí (apoptózou), které již nebyly schopny dokončit mitózu. Lokalizace tohoto proteinu během telofáze naznačuje možné spojení s cytokinezí.

  Krásná neznámá Plk4, která je v současné době předmětem našich experimentů, též negativně ovlivňuje buněčný růst a stará se doposud neznámým způsobem o to, aby naše buňky měly optimální velikost.

Rodina v předivu vztahů

Představili jsme jednu z mnoha rodin proteinkináz, které kontrolují množení a diferenciaci buněk. Je nepochybné, že je tato rodina zapojena v jemném předivu zpětnovazebných kontrol, které pomocí fosforylačních a defosforylačních změn zaručují jak kontrolované dělení somatických buněk a jejich cílenou diferenciaci ve tkáních (viz obrázek), tak bezchybné vytváření zárodečných buněk, které umožní produkci životaschopného potomstva. Při studiu členů této rodiny je třeba sledovat nejen jejich obecnou biologickou funkci, ale i jejich tkáňovou a orgánovou roli a také druhově specifické rysy. Lze si jen přát, aby soustředěný výzkum v brzké době nashromáždil dostatek vědomostí, které by umožnily jak včasné rozpoznání buněk nepodléhajících kontrole buněčného cyklu, tak jejich následné zneškodnění.