O buněčném odpadu

Z dnešního pohledu se nám zdá spíše logické, že přebytečné, pokažené nebo nepotřebné bílkoviny musí být z buňky účinně a pokud možno kontrolovaně odstraněny. To vše se nejčastěji děje procesem degradace závislé na ubikvitinaci. Princip je jednoduchý: na bílkovinu, která má být zničena, je navázano několik molekul ubikvitinu (jiné bílkoviny), což ji předurčuje k trpkému konci ve specializovaném buněčném drtiči odpadů zvaném protea zom (detailněji viz rámeček 1 a obrázek). Přes tuto zdánlivou jednoduchost objev přinesl tři převratně nové náhledy na biologii buňky:

• Nepotřebné, nadbytečné či poškozené bílkoviny musí být z buňky aktivně, rychle a účinně odstraněny. Buňka nečeká, až se tyto bílkoviny pozvolna samovolně rozpadnou (což zaručují termodynamické zákony), nýbrž vynakládá na jejich odstranění značné množství energie.
• Degradace bílkovin je velmi přísně regulována. Specifi tu celého procesu zajišťuje obrovský počet proteinů. Jakékoliv nepřesnosti v tomto procesu vedou k těžkému poškození či smrti buňky, u mnohobuněčných organizmů (např. u lidí) způsobují těžké patologické změny.
• Již dříve se vědělo, že funkce bílkovin může být ovlivněna navázáním jiných molekul. Ve většině případů jde o návázání cukru, fosfátové skupiny či jiné malé nebílkovinné molekuly. Na příkladu ubikvitinu bylo ukázáno, že bílkovina může být modifikována i navázáním jiné bílkoviny.

Letošní laureáti Nobelovy ceny za chemii Aaron Ciechanover, Avram Hershko a Irwin Rose, ale i řada dalších vědců (viz rámeček 2 ) odhalili celý proces spíše náhodně a trvalo téměř desetiletí, než dosah jejich objevu pochopila vědecká veřejnost. Najde se jen málo buněčných procesů, při nichž degradace závislá na ubikvitinu nehraje roli. Zřejmě největším zadostiučiněním pro trojici loňských laureátů je tedy nejenom Nobelova cena, ale i neobyčejná důležitost procesu ubikvitinace pro buněčné funkce. Podívejme se proto na hlavní příklady ubikvitinu v akci a na některá nečekaná odhalení, která studium ubikvitinu přineslo.

Obyčejný odpad

Bílkoviny se běžným používáním v buňce opotřebují, mnohé bývají poničeny vnějšími vlivy, jako jsou například volné radikály či zvýšená teplota, jiné byly nekvalitně vyrobeny nebo nebyly sbaleny do správné prostorové struktury. Poškozené bílkoviny jsou pro buňku velkým rizikem. Jednak nejsou schopny vykonávat svou funkci, jednak mají tendenci vytvářet neforemné agregáty, které snižují životaschopnost buněk. Proto jsou poškozené a nefunkční bílkoviny rozeznány, označeny ubikvitinem a zničeny. Zdá se, že buňka pro jistotu pravidelně obnovuje všechny bílkoviny, i pokud nejsou poškozené, a to velmi organizovaně. Zatímco některé bílkoviny se obnovují ve velmi krátkých intervalech (poločas života zhruba 4 minuty), jiné setrvávají v oběhu i několik hodin či dní (hemoglobin má životnost více než 100 dní). Podle jakého klíče je o životnosti bílkovin rozhodováno či jak buňka rozeznává poškozenou bílkovinu, není moc jasné. Prozatím bylo odhaleno několik strategií, které buňka využívá. Podle „pravidla N-konce“ rozhoduje o životnosti bílkovin poslední aminokyselina na N-konci bílkoviny. ¹⁾ Zatímco některé aminokyseliny odkazují bílkovinu k rychlému zániku, jiné jí zaručují dlouhý život. V některých bílkovinách byl zase objeven „destrukční box“, což je krátký úsek aminokyselin předurčující bílkovinu k degradaci závislé na ubikvitinu. Mnohé bílkoviny jsou sbalené v prostoru tak, že mají destrukční box hluboko a nedosažitelně skrytý. Teprve působení nějakého vnějšího faktoru (např. zvýšené teploty) je přinutí trojrozměrnou strukturu změnit a box odhalit. Dnes je odborníkům jasné, že existuje mnoho dalších strategií, jimiž buňka rozeznává proteiny určené k sešrotování. Jejich odhalování přinese jistě řadu dalších překvapení.

Nejúčinnější řešení

Velmi nečekané bylo zjištění, že degradace proteinů v buňce může sloužit jako mimořádně účinný princip regulace. Život buňky je, zjednodušeně řečeno, časová posloupnost procesů, při níž proces následující nastane teprve po úplném a úspěšném dokončení procesu předchozího. Jak ale rychle a čistě ukončit děj, který předtím probíhal poměrně dlouhou dobu a během nějž byla vyrobena řada specifi ckých, pro tento děj nezbytných bílkovin? V takovém případě se často rychle ničí – právě degradací závislou na ubikvitinu – bílkoviny potřebné pro již ukončený proces (nebo inhibitory procesu následujícího). Jako kdyby rodiče, kteří nechtějí, aby se jejich děti dívaly v noci na televizi, ji prostě úderem desáté vyhodili z okna. Marnotratnost? Jistě, ale funguje to stoprocentně.

Klíčem pro tento typ regulace jsou enzymy E3 neboli ubikvitin-ligázy (viz rámeček 1 ). Enzymy E3 totiž určují specifitu navázání ubikvitinu a ta je v daném případě mimořádně důležitá – nestačí jenom něco vyhodit z okna, je potřeba vyhodit z okna právě a jen televizi. V buňkách existuje obrovské množství ubikvitin-ligáz E3, pro každou konkrétní situaci jiná. Některé z nich jsou jednoduché bílkoviny, jiné jsou tvořeny mnoha podjednotkami, všechny jsou však pro příslušné buněčné procesy naprosto klíčové. Zdá se, že regulace pomocí degradace je mimořádně vhodná pro ovlivňování procesů, u nichž závisí zejména na časové posloupnosti. Nejlépe je tento princip prostudován právě u regulace buněčného cyklu. Například ubikvitin-ligáza SCF je tvořena nejméně třemi proteiny a je nezbytná pro regulaci buněčného cyklu například během zahájení replikace (zajišťuje degradaci inhibitoru replikace). Gigantický APC/cyklozom je tvořen nejméně 16 bílkovinami a je mimo jiné nezbytný k tomu, aby se při mitóze přesně načasoval začátek rozdělení chromozomů do dvou dceřiných buněk. Jak SCF, tak APC/cyklozom jsou esenciální pro život buňky, jakékoliv poškození znamená smrt.

Degradace jako princip regulace není však zdaleka vyhraněna jen pro buněčný cyklus. Zdá se, že svoji roli hraje i při opravách DNA (například komplex BRCA1/BARD, geny Fanconi) či při regulaci apoptózy. O tom snad ale až někdy jindy.

Jeden ubikvitin degradaci nezařídí, ale…

Kupodivu ne vždy předurčuje navázání ubikvitinu bílkovinu k zničení. Někdy je ubikvitinace signálem k lokalizaci bílkoviny na určitém místě v buňce či ovlivňuje její aktivitu. Rozhodující je počet navázaných molekul ubikvitinu. Pokud se naváže řetězec nejméně 4 ubikvitinů, je bílkovina určena k degradaci. Jeden ubikvitin (monoubikvitinace) funkci bílkoviny pouze modifikuje. Monoubikvitinace bílkovin hraje významnou roli zejména při endocytóze proteinů buněčné membrány, při určení cílové lokalizace některých proteinů, v opravách DNA, aktivitě histonů a chromatinu vůbec, jakož i při regulaci buněčné transkripce. Ze seznamu je vidno, že probrání všeho by zabralo trochu víc času, proto se podívejme jenom na pár zajímavých případů. Jedním z nejprostudovanějších je monoubikvitinace při endocytóze receptorů. Bílkovinné receptory trčí z buněčné membrány do mezibuněčného prostoru a loví ligandy (hormony, antigeny, růstové faktory a další signální molekuly). Navázáním ligandu se receptor aktivuje, a tím je „přivolána“ specifická ubikvitin-ligáza. Ta příslušný receptor s ligandem monoubikvitinuje, což je signál k vtažení (internalizaci) tohoto receptoru do buňky. V buňce je ligand odštěpen a receptor buď zničen v proteazomu, nebo znovu umístěn na buněčnou membránu. V obou případech jsou navázané molekuly ubikvitinu odštěpeny a znovu využity. Výhody tohoto systému jsou zřejmé. Zaprvé si buňka vtažením receptoru s navázaným ligandem „přečte“ příslušný vzkaz zvenčí. Zadruhé je receptor s navázaným ligandem buňce na nic – nemůže totiž už nic jiného navázat, stane se necitlivým. Po internalizaci může buňka ligand i ubikvitin odštěpit. Receptor je díky tomu znovu citlivý a může být znova využit pro lov signálů. Pokud jeho role už skončila a další signály nejsou potřeba, specifické ubikvitin-ligázy jenom připojí k prvnímu ubikvitinu pár dalších molekul a nepotřebný receptor skončí v popelnici proteazomu.

Možnost využít stejný systém buď k modifikaci funkce, nebo rovnou k zničení se zdá velmi výhodný a buňka na tom dost ušetří. Vědcům to ale spíše přidělalo starosti. Zatím totiž vůbec nechápeme, jak se rozhodne, zda bude cílový protein monoubikvitinován, či zda jej ověnčí celý smuteční věnec mnoha ubikvitinů znamenající jistý konec v proteazomu. A tak nás i v této oblasti ještě čekají netušená překvapení.

Ubikvitin a jeho bráškové

Devadesátá léta přinesla vědcům zabývajícím se ubikvitinem nejeden šok. Mezi zásadní objevy patřilo i zjištění, že ubikvitin není jediná bílkovina, která svým navázáním na jinou bílkovinu ovlivňuje její osud i funkci. Dnes známe řadu „příbuzných“ ubikvitinu, například SUMO, Hub a Nedd (ano, skutečně mají tak bizarní jména). Obvykle jde o malé globulární bílkoviny, které jsou ubikvitinu velmi podobné a stejně jako on jsou navázány či v případě potřeby zase odštěpeny od nějaké cílové bílkoviny, jejíž funkci ovlivňují. Nejprostudovanější je zatím SUMO, který jako by ubikvitinu z oka vypadl (tedy skoro). Na rozdíl od ubikvitinu nevede navázání SUMO nikdy k degradaci označené bílkoviny. SUMO ovlivňuje činnost a umístění nejrůznějších proteinů, které se převážně účastní regulace genové exprese či oprav DNA. SUMO je v buňce častým protivníkem ubikvitinu. Vzhledem k tomu, že se obě tyto malé bílkoviny mohou vázat na stejné místo na cílovém proteinu, hojně spolu o navázání soutěží. Osud bílkoviny či její funkce pak zásadním způsobem závisí na tom, kdo vyhraje. Pokud vyhraje ubikvitin, bílkovina je většinou degradována v proteazomu, zatímco při navázání SUMO se často jen mění její aktivita. V případě některých transkripčních faktorů vede návázání SUMO k represi transkripce, zatímco navázání jednoho ubikvitinu způsobí zvýšení transkripce. Rovnováha mezi procesy se SUMO a ubikvitinem ovlivňuje také některé typy oprav DNA.

O ubikvitinu ještě uslyšíme!

Letošním laureátům Nobelovy ceny se před lety jistě ani nesnilo, jaký dosah bude mít jejich studium malého a všudypřítomného proteinu, který tehdy ani neměl pořádné jméno. Posledních několik let se role pro ubikvitin objevuje snad v každé oblasti fyziologie buňky, přestože zůstává řada základních otázek zatím nezodpovězena.

Velká budoucnost se připisuje využití znalosti ubikvitinace a proteazomu ve farmakologii. Mnohé neurodegenerativní choroby jsou spojeny s akumulací nefunkčních a nedegradovatelných proteinů v neuronech. Nadějí by mohlo být právě zvýšení degradace závislé na ubikvitinaci. Také pro léčbu některých typů leukemií může být proteazom ten pravý cíl. Zdá se totiž, že hromadění poškozených proteinů způsobuje v některých buňkách apoptózu. Cílená inhibice proteazomu vede právě k tomu, že se poškozené proteiny v buňce hromadí. V květnu 2003 byl pro léčbu mnohočetných myelomů schválen lék Velcade, který je inhibitorem proteazomu.

Mnohočetné myelomy jsou agresivní a špatně léčitelná onemocnění a tak jsou naděje upřené k Velcade pochopitelné. A to je teprve začátek, brzy se jistě objeví další léky.

Důležitost proteazomového systému a ubikvitinace tak naznačují i jednu všeobecnou poučku: Chceš-li přežít, řádně se starej o veškerý odpad!

Nobelovu cena za chemii získali v roce 2004 Aaron Ciechanover, Avram Hershko a Irwin Rose za objev mechanizmu, kterým buňky odstraňují nežádoucí bílkoviny.