Aktuální číslo:

2021/5

Téma měsíce:

150 let Vesmíru

Konfokální a dvoufotonová mikroskopie

 |  15. 3. 2004
 |  Vesmír 83, 4, 2004/3

Když se řekne mikroskop, většině lidí se vybaví mikroskop optický, s nímž se setkali ve škole při pozorování trepky nebo buněk cibulové slupky. První optický mikroskop byl sestrojen v holandských dílnách někdy v letech 1590–1609, v souvislosti s tím bývají uváděna jména Hans Jansen a jeho syn Zacharias, a dále Hans Lippershey. Během následujících staletí byl však stále zdokonalován.

Mezi novější metody optické mikroskopie patří konfokální 1) mikroskopie, která výrazným způsobem rozšířila možnosti pozorování zejména biologických objektů. Její princip patentoval americký vědec Marvin Minsky r. 1957, avšak jeho vynález našel širší uplatnění až o třicet let později. Do historie konfokální mikroskopie se zapsali také Mojmír Petráň a Milan Hadravský z Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Plzni, kteří r. 1965 zkonstruovali nový typ konfokálního mikroskopu – mikroskop s dvojitým řádkováním (tandemový skenovací mikroskop) a r. 1968 jej patentovali.

Při pozorování v konfokálním mikroskopu je studovaný vzorek osvětlen bodovým zdrojem světla, nejčastěji laserovým paprskem. Speciální konfokální clonka skryje zobrazení oblastí nad a pod rovinou zaostření, a tím odstraní příčinu „rozmazání“ obrazu při pohledu na tlustší vzorky v klasickém optickém mikroskopu (obrázek). V současné době je nejpoužívanějším přístrojem tohoto typu laserový rastrovací konfokální mikroskop, v němž je obraz roviny zaostření získán rastrováním zorného pole rozmítáním laserového paprsku. Tento mikroskop byl uveden na trh v osmdesátých letech 20. století.

Mezi hlavní přednosti konfokální mikroskopie ve srovnání s klasickou optickou mikroskopií je možnost vést tenké optické řezy i tlustším vzorkem, a dokonce zaznamenávat série digitalizovaných řezů vzorkem. Tyto sériové řezy jsou navíc přesně slícovány, a tak představují vhodná vstupní data pro studium trojrozměrné struktury objektů.

Dvoufotonový mikroskop je nový typ optického mikroskopu. Poprvé jej r. 1990 představili američtí vědci v čele s Wattem W. Webbem z Cornellovy univerzity v Ithace. Podobně jako „klasický“ konfokální mikroskop umožnuje zobrazovat tenké optické řezy tlustším vzorkem, jeho princip je však odlišný. Místo jednofotonové excitace využívá speciální laser k excitaci dvěma fotony, které jsou absorbovány téměř současně, s šířkou pulzu řádově pouhých 100 femtosekund. Pravděpodobnost dvoufotonové excitace je úměrná druhé mocnině intenzity excitačního pole. Je nejvyšší v rovině zaostření, a proto k získání obrazů optických řezů vzorkem nepotřebujeme konfokální clonku. Mezi výhody dvoufotonové mikroskopie ve srovnání s mikroskopií konfokální patří například větší hloubka proostření (až do 400 μm), a to i u vzorků, jejichž povrchové vrstvy silně fluoreskují, dále pak zvýšený podíl signálu vůči šumu, tedy i kontrastnější zobrazení, zejména v hlubších vrstvách vzorku (obrázek).

Konfokální a dvoufotonová mikroskopie má široké využití v mnoha biologických oborech, např. v buněčné a molekulární biologii a ve fyziologii. Umožňuje zobrazit tenké optické řezy buňkami či tkáněmi a určit vzájemnou polohu jejich různých komponent s využitím vícenásobného barvení (obrázek). Při fyziologických studiích bývají často využívány časové série, zaznamenávající časové změny např. v koncentraci různých iontů v daných oblastech studovaného vzorku. Digitální obrazy sérií optických řezů představují data vhodná pro kvantitativní měření i pro počítačové trojrozměrné rekonstrukce poměrně velkých oblastí vzorku, aniž je nutné řešit problém lícování následných fyzických sériových řezů ().

V České republice byl první laserový konfokální mikroskop instalován r. 1993 v oddělení biomatematiky Fyziologického ústavu Akademie věd ČR, kde byl rovněž o deset let později uveden do provozu první dvoufotonový mikroskop.

Poznámky

1) Připoměňme, že jako konfokální se označuje to, co je sdružené s ohniskem (konjugovaný + fokální = konfokální). V tomto případě je s ohniskem čočky objektivu (tj. s místem zaostření ve vzorku) sdružená jak optická soustava, která osvětluje, tak i ta, která zobrazuje. Jinými slovy je do téhož „bodu“ zaostřen paprsek osvětlovací i paprsek zprostředkující pozorování.
OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Mikroskopie

O autorovi

Lucie Kubínová

 

Doporučujeme

Jaké to je být fanouškem

Jaké to je být fanouškem

Dan Bárta  |  3. 5. 2021
Jsem ročník 1969. Poprvé jsem uviděl Vesmír na stole v kuchyni u svého spolužáka z gymplu v půlce osmdesátek. Na mou nejapnou otázku, jestli „jede...
Složitá jednoduchost virů

Složitá jednoduchost virů uzamčeno

Ivan Hirsch, Pavel Plevka  |  3. 5. 2021
Místo tradičního redakčního rozhovoru tentokrát nabízíme dialog virologů dvou generací a odlišných specializací, Ivana Hirsche a Pavla Plevky.
Časy Vesmíru

Časy Vesmíru

Tomáš Hermann  |  3. 5. 2021
První číslo Vesmíru vyšlo 3. května 1871, časopis tedy letošním květnovým číslem slaví 150. narozeniny. Při cestě do jeho historie můžeme za...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné