Aktuální číslo:

2018/12

Téma měsíce:

Jednotky SI

Konfokální a dvoufotonová mikroskopie

 |  15. 3. 2004
 |  Vesmír 83, 4, 2004/3

Když se řekne mikroskop, většině lidí se vybaví mikroskop optický, s nímž se setkali ve škole při pozorování trepky nebo buněk cibulové slupky. První optický mikroskop byl sestrojen v holandských dílnách někdy v letech 1590–1609, v souvislosti s tím bývají uváděna jména Hans Jansen a jeho syn Zacharias, a dále Hans Lippershey. Během následujících staletí byl však stále zdokonalován.

Mezi novější metody optické mikroskopie patří konfokální 1) mikroskopie, která výrazným způsobem rozšířila možnosti pozorování zejména biologických objektů. Její princip patentoval americký vědec Marvin Minsky r. 1957, avšak jeho vynález našel širší uplatnění až o třicet let později. Do historie konfokální mikroskopie se zapsali také Mojmír Petráň a Milan Hadravský z Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Plzni, kteří r. 1965 zkonstruovali nový typ konfokálního mikroskopu – mikroskop s dvojitým řádkováním (tandemový skenovací mikroskop) a r. 1968 jej patentovali.

Při pozorování v konfokálním mikroskopu je studovaný vzorek osvětlen bodovým zdrojem světla, nejčastěji laserovým paprskem. Speciální konfokální clonka skryje zobrazení oblastí nad a pod rovinou zaostření, a tím odstraní příčinu „rozmazání“ obrazu při pohledu na tlustší vzorky v klasickém optickém mikroskopu (obrázek). V současné době je nejpoužívanějším přístrojem tohoto typu laserový rastrovací konfokální mikroskop, v němž je obraz roviny zaostření získán rastrováním zorného pole rozmítáním laserového paprsku. Tento mikroskop byl uveden na trh v osmdesátých letech 20. století.

Mezi hlavní přednosti konfokální mikroskopie ve srovnání s klasickou optickou mikroskopií je možnost vést tenké optické řezy i tlustším vzorkem, a dokonce zaznamenávat série digitalizovaných řezů vzorkem. Tyto sériové řezy jsou navíc přesně slícovány, a tak představují vhodná vstupní data pro studium trojrozměrné struktury objektů.

Dvoufotonový mikroskop je nový typ optického mikroskopu. Poprvé jej r. 1990 představili američtí vědci v čele s Wattem W. Webbem z Cornellovy univerzity v Ithace. Podobně jako „klasický“ konfokální mikroskop umožnuje zobrazovat tenké optické řezy tlustším vzorkem, jeho princip je však odlišný. Místo jednofotonové excitace využívá speciální laser k excitaci dvěma fotony, které jsou absorbovány téměř současně, s šířkou pulzu řádově pouhých 100 femtosekund. Pravděpodobnost dvoufotonové excitace je úměrná druhé mocnině intenzity excitačního pole. Je nejvyšší v rovině zaostření, a proto k získání obrazů optických řezů vzorkem nepotřebujeme konfokální clonku. Mezi výhody dvoufotonové mikroskopie ve srovnání s mikroskopií konfokální patří například větší hloubka proostření (až do 400 μm), a to i u vzorků, jejichž povrchové vrstvy silně fluoreskují, dále pak zvýšený podíl signálu vůči šumu, tedy i kontrastnější zobrazení, zejména v hlubších vrstvách vzorku (obrázek).

Konfokální a dvoufotonová mikroskopie má široké využití v mnoha biologických oborech, např. v buněčné a molekulární biologii a ve fyziologii. Umožňuje zobrazit tenké optické řezy buňkami či tkáněmi a určit vzájemnou polohu jejich různých komponent s využitím vícenásobného barvení (obrázek). Při fyziologických studiích bývají často využívány časové série, zaznamenávající časové změny např. v koncentraci různých iontů v daných oblastech studovaného vzorku. Digitální obrazy sérií optických řezů představují data vhodná pro kvantitativní měření i pro počítačové trojrozměrné rekonstrukce poměrně velkých oblastí vzorku, aniž je nutné řešit problém lícování následných fyzických sériových řezů ().

V České republice byl první laserový konfokální mikroskop instalován r. 1993 v oddělení biomatematiky Fyziologického ústavu Akademie věd ČR, kde byl rovněž o deset let později uveden do provozu první dvoufotonový mikroskop.

Poznámky

1) Připoměňme, že jako konfokální se označuje to, co je sdružené s ohniskem (konjugovaný + fokální = konfokální). V tomto případě je s ohniskem čočky objektivu (tj. s místem zaostření ve vzorku) sdružená jak optická soustava, která osvětluje, tak i ta, která zobrazuje. Jinými slovy je do téhož „bodu“ zaostřen paprsek osvětlovací i paprsek zprostředkující pozorování.
OBORY A KLÍČOVÁ SLOVA: Mikroskopie

O autorovi

Lucie Kubínová

 

Doporučujeme

Poprask kolem dvojčat, prvních dětí s editovaným genomem

Poprask kolem dvojčat, prvních dětí s editovaným genomem

Jaroslav Petr  |  13. 12. 2018
V čem udělali čínští soudruzi chybu? Čínský experiment odstartoval genetické vylepšování lidstva bezpříkladně zpackaným způsobem.
Tanec mezi pravděpodobnostmi

Tanec mezi pravděpodobnostmi

Ondřej Vrtiška  |  3. 12. 2018
Forenzní genetička Halina Šimková donedávna v Kriminalistickém ústavu Praha analyzovala DNA a pomáhala odhalovat vrahy, násilníky a zloděje. To ji...
Sedm základních kamenů

Sedm základních kamenů

Ivan Boháček  |  3. 12. 2018
Začalo to metrem. Ve dnech, kdy jde toto číslo Vesmíru do tiskárny, probíhá ve Versailles 26. konference pro váhy a míry (CGPM, Conférence...

Předplatným pomůžete zajistit budoucnost Vesmíru

Tištěná i elektronická
verze časopisu
Digitální archiv
od roku 1994
Speciální nabídka
pro školy a studenty

 

Objednat předplatné