Konfokální a dvoufotonová mikroskopie

Když se řekne mikroskop, většině lidí se vybaví mikroskop optický, s nímž se setkali ve škole při pozorování trepky nebo buněk cibulové slupky. První optický mikroskop byl sestrojen v holandských dílnách někdy v letech 1590–1609, v souvislosti s tím bývají uváděna jména Hans Jansen a jeho syn Zacharias, a dále Hans Lippershey. Během následujících staletí byl však stále zdokonalován.

Mezi novější metody optické mikroskopie patří konfokální ¹⁾ mikroskopie, která výrazným způsobem rozšířila možnosti pozorování zejména biologických objektů. Její princip patentoval americký vědec Marvin Minsky r. 1957, avšak jeho vynález našel širší uplatnění až o třicet let později. Do historie konfokální mikroskopie se zapsali také Mojmír Petráň a Milan Hadravský z Lékařské fakulty Univerzity Karlovy v Plzni, kteří r. 1965 zkonstruovali nový typ konfokálního mikroskopu – mikroskop s dvojitým řádkováním (tandemový skenovací mikroskop) a r. 1968 jej patentovali.

Při pozorování v konfokálním mikroskopu je studovaný vzorek osvětlen bodovým zdrojem světla, nejčastěji laserovým paprskem. Speciální konfokální clonka skryje zobrazení oblastí nad a pod rovinou zaostření, a tím odstraní příčinu „rozmazání“ obrazu při pohledu na tlustší vzorky v klasickém optickém mikroskopu (obrázek). V současné době je nejpoužívanějším přístrojem tohoto typu laserový rastrovací konfokální mikroskop, v němž je obraz roviny zaostření získán rastrováním zorného pole rozmítáním laserového paprsku. Tento mikroskop byl uveden na trh v osmdesátých letech 20. století.

Mezi hlavní přednosti konfokální mikroskopie ve srovnání s klasickou optickou mikroskopií je možnost vést tenké optické řezy i tlustším vzorkem, a dokonce zaznamenávat série digitalizovaných řezů vzorkem. Tyto sériové řezy jsou navíc přesně slícovány, a tak představují vhodná vstupní data pro studium trojrozměrné struktury objektů.

Dvoufotonový mikroskop je nový typ optického mikroskopu. Poprvé jej r. 1990 představili američtí vědci v čele s Wattem W. Webbem z Cornellovy univerzity v Ithace. Podobně jako „klasický“ konfokální mikroskop umožnuje zobrazovat tenké optické řezy tlustším vzorkem, jeho princip je však odlišný. Místo jednofotonové excitace využívá speciální laser k excitaci dvěma fotony, které jsou absorbovány téměř současně, s šířkou pulzu řádově pouhých 100 femtosekund. Pravděpodobnost dvoufotonové excitace je úměrná druhé mocnině intenzity excitačního pole. Je nejvyšší v rovině zaostření, a proto k získání obrazů optických řezů vzorkem nepotřebujeme konfokální clonku. Mezi výhody dvoufotonové mikroskopie ve srovnání s mikroskopií konfokální patří například větší hloubka proostření (až do 400 μm), a to i u vzorků, jejichž povrchové vrstvy silně fluoreskují, dále pak zvýšený podíl signálu vůči šumu, tedy i kontrastnější zobrazení, zejména v hlubších vrstvách vzorku (obrázek).

Konfokální a dvoufotonová mikroskopie má široké využití v mnoha biologických oborech, např. v buněčné a molekulární biologii a ve fyziologii. Umožňuje zobrazit tenké optické řezy buňkami či tkáněmi a určit vzájemnou polohu jejich různých komponent s využitím vícenásobného barvení (obrázek). Při fyziologických studiích bývají často využívány časové série, zaznamenávající časové změny např. v koncentraci různých iontů v daných oblastech studovaného vzorku. Digitální obrazy sérií optických řezů představují data vhodná pro kvantitativní měření i pro počítačové trojrozměrné rekonstrukce poměrně velkých oblastí vzorku, aniž je nutné řešit problém lícování následných fyzických sériových řezů ().

V České republice byl první laserový konfokální mikroskop instalován r. 1993 v oddělení biomatematiky Fyziologického ústavu Akademie věd ČR, kde byl rovněž o deset let později uveden do provozu první dvoufotonový mikroskop.