Susan Lindquistová a její evoluční hereze

Existuje vztah mezi stresem a rychlostí evoluce? Je možné najít jednotící molekulární mechanizmy pro kontrolu rychlosti evolučních změn s ohledem na typ změny vnějšího prostředí? Je možné v evoluci odpojit variabilitu genotypovou od fenotypové? Tyto donedávna pouze spekulativní otázky si kladou recenzenti i čtenáři článků pocházejících z chicagské laboratoře Susan Lindquistové, kde se v posledních dvou letech podařilo otestovat hned dva možné molekulární scénáře, podle nichž prostředí může přímo ovlivňovat evoluci morfologických, fyziologických a metabolických znaků.

Role prionů v evoluci

S problematikou prionů se na stránkách Vesmíru setkáváme poměrně často. Je to dáno tím, že priony do biologie vnášejí nový pohled na staré jevy, a tím se podílejí na erozi „genocentrického“ biologického světového názoru. Navíc epigenetické fenomény spojené s replikací prionů již obsadily čestné místo na prvních stranách světových deníků a vzhledem k tomu, že brzké ukončení pandemie bovinní spongiformní encefalopatie (nemoci šílených krav) či Creutzfeldtovy-Jacobovy choroby je nepravděpodobné, ještě nějaký čas o svou popularitu nepřijdou. Tato onemocnění mají společného jmenovatele – variantu prionového proteinu (PrP) schopnou změnit tvar přirozeně fungujícího proteinu na trojrozměrné uspořádání, jež je v důsledku změny infekční a ještě ke všemu odolné vůči proteázám (enzymům štěpícím bílkoviny). Pozměněný PrP se hromadí v místě své nejvyšší syntézy, totiž v mozku. Tam za nějaký čas odumře nervová tkáň. Následují dramatické neurodegenerativní projevy, které končí smrtí. Mnohem méně se ví (i když v naší pivařské zemi je to s podivem), že kromě „šílených krav“ existují též „[PSI]chotické“ kvasinky, jejichž neobvyklý, evolučně nesmírně zajímavý fenotyp je určován podobnými mechanizmy, jaké probíhají při zmíněných onemocněních savců.

Co jsou to kvasinkové priony? Kvasinkový fenotyp [PSI⁺] popsal r. 1965 B. Cox jako faktor, který ovlivňuje přesnost terminace translace. Když jsou buňky Saccharomyces cerevisiae (kvasinky pivní) ve stavu [PSI⁺] (na rozdíl od [psi^–]), vzrůstá pravděpodobnost, že se „propřekládají“ přes STOP-kodony, které normálně určují konec translace. Podobné signály vznikají též mutacemi (když se triplet, který původně kódoval aminokyselinu, změní ve STOP-kodon), čímž je většinou znemožněna syntéza příslušného kompletního funkčního proteinu. V této vlastnosti není [PSI⁺] příliš výjimečný, existuje řada dalších terminačních faktorů. Pro [PSI⁺] je však unikátní typ dědičnosti, jímž se přenáší na potomstvo. I kvasinky jsou totiž schopny své verze pohlavního rozmnožování, při němž bychom po redukčním meiotickém dělení u heterozygota očekávali mendelovské vyštěpení znaku 1[PSI⁺]:1[psi^–]. Pravda je však taková, že „gen psi“ se chová nemendelovsky – všechny čtyři haploidní buňky vzniklé při meióze jsou [PSI⁺]! Tak je [PSI⁺] přenášen na potomstvo jako dominantní nemendelovský znak. Ani to však není zcela mimořádné – podobným způsobem se mohou dědit organely s vlastní DNA, plazmidy nebo viry. Jev začal být skutečně zajímavý v okamžiku, kdy se podařilo vyloučit podíl nukleové kyseliny na nemendelovském typu dědičnosti a kdy se ukázalo, že buňky kvasinek dokážou přepínat mezi fenotypy [PSI⁺] a [psi^–]. Faktory, které zvyšují pravděpodobnost těchto konverzí, nejsou mutagenní (nemění strukturu nukleových kyselin), ale ovlivňují stabilitu proteinů. Jde tedy o podobnou situaci, která byla pozorována u obratlovčích prionových proteinů. Od tohoto pozorování již nebylo daleko k prionovému vysvětlení pozorovaného fenoménu. Bylo však ještě třeba najít kvasinkový prion, který podobně jako obratlovčí prionový protein musí být kódován nějakým genem.

V roce 1992 se podařilo fenotyp [PSI⁺] ztotožnit s genem SUP35, který je spolu s genem SUP45 odpovědný za schopnost správně rozpoznat terminační signál pro translaci, STOP-kodon. Klíčem k prionovému chování proteinu kódovaného genem SUP35–Sup35 je podobně jako u obratlovčího prionového proteinu PrP primární struktura – tedy pořadí aminokyselin. V obou proteinech se vyskytují unikátní osmiaminokyselinová opakování, která jsou odpovědná za „prionovitost“ těchto molekul, popř. i zcela odlišných proteinů, pokud jsou k nim pomocí genového inženýrství „přišity“. Mezi PrP a Sup35 je však jeden zásadní rozdíl. Zdá se totiž, že přeměna buněčné formy prionového proteinu PrP^C na formu infekční PrP^Sc je jednosměrný proces, který končí neurodegenerativním onemocněním a smrtí postiženého savce. V případě Sup35 jsou prionu otevřena vrátka zpět. Tato vratnost tvarové změny umožňuje (zhruba s pravděpodobností 10⁵ na generaci) překlápění mezi fenotypy [PSI⁺] a [psi^–]. Uplatňují se při tom některé skupiny proteinů teplotního šoku (HSP27 a HSP70), buněčné dělení a vlivy vnějšího prostředí.

V koloniích [psi^–] se tak přibližně každá stotisící buňka „zvrhne“, přebalí jeden ze svých terminačních faktorů (zmíněný Sup35), a ten začne tvořit nerozpustná vlákna, neschopná řídit správné ukončování translace proteinů. Přestanou fungovat translační STOP-signály a v buňce se objeví anomální proteiny – mají jeden z konců delší o aminokyseliny, které se za normálních okolností z mRNA nepřekládají do proteinové sekvence. Takto postižené proteiny získávají nové vlastnosti. V podstatě totiž platí, že trojrozměrné uspořádání bílkovin je závislé na primární struktuře – na pořadí jednotlivých aminokyselin spojených peptidickou vazbou do lineární struktury. Změna sekvence aminokyselin pak vede ke změně tvaru bílkoviny, což se dále promítne do odlišných fyzikálně-chemických vlastností příslušného proteinu (reakční kinetiky u enzymů, schopnosti vytvářet vláknité struktury u cytoskeletárních komponent, schopnosti měnit konformaci u receptorů a signalizačních molekul nebo vázat se na DNA u transkripčních faktorů).

Perfektně sehraný orchestr buněčných bílkovin, vycepovaný dlouhodobým působením přísného evolučního dirigenta, začne hrát falešně. K čemu je dobrá kakofonie rozladěných proteinů, která má za normálních podmínek v konkurenci onačejších „těles“ minimální šanci na úspěch? Odpověď se skrývá právě v definici „normálních podmínek“. Ty totiž existují jen uvnitř laboratoří, přesněji řečeno uvnitř Petriho misek pro kultivaci mikroorganizmů, jimž jsou vědci schopni namíchat ty nejchutnější a nejvýživnější koktejly, které i ten nejotrlejší „divoký“ kmen rozmazlí v primadonu. Vně laboratoří však zuří boj o přežití v neustále se měnících podmínkách, kde není čas ani dokonale naladit, ani se dohodnout na skladbě, která se má hrát, neboť stále se střídající dirigenti dávají často protichůdné příkazy. Laboratorní zhýčkanci pak v reálné situaci nemají šanci – často totiž pro cvičení „co nejrychlejší hry“ (tj. co nejrychlejšího množení za optimalizovaných podmínek) ztratí schopnost žít pod tlakem, čímž se dopustí evolučního zločinu trestaného vyhynutím. To je jeden z důvodů, proč bychom se snad nemuseli tolik bát toho, že nezodpovědným vědcům „něco uteče, a pak nás to všechny zahubí“ – vesměs totiž využívají a pomocí molekulární genetiky upravují vysoce hendikepované jedince.

Selský rozum nám říká, že je výhodné umět si zajistit spokojené fungování v období pohody, kdy je co jíst, je příjemné teplíčko a máme pocit, že jsme v přepychové Petriho misce, ale také umět přežít za stresových podmínek, do nichž by psa nevyhnal, tím méně evoluční subjekt. Ještě nedávno se zdálo, že splnit obé je nad síly evolučního architekta. V předcházejících odstavcích máme všechna fakta nezbytná pro konstrukci systému, který by mohl fungovat a – jak Susan Lindquistová s Hether Trueovou dokázaly – i reálně funguje (viz rámeček 1).

Vyvstává tak před námi hezká, vnitřně konzistentní konstrukce, v níž se operuje se vztahy mezi stresem, skrytou variabilitou, terminačním prionem, proteiny teplotního šoku a přírodním výběrem. Lze ji však experimentálně potvrdit, nebo naopak vyvrátit?

Susan Lindquistová a Hether Trueová se o to pokusily. Vystavily kvasinkové fenotypy [PSI⁺] a [psi^–] asi 150 různým podmínkám vnějšího prostředí a zjistily, že v téměř padesáti procentech případů prion změnil rychlost růstu, přičemž ve více než čtvrtině případů ji zvýšil – tudíž byl pro kvasinku výhodný. Kromě měřitelných výhod pro růst kvasinek se objevily i jiné jevy – například zcela nová morfologie kvasinkových kolonií. Zdá se tedy, že se alespoň u pivních kvasinek podařilo prokázat existenci přesně definovaného molekulárního mechanizmu, jímž je možné zareagovat na stresové podmínky vnějšího prostředí, změnit fenotyp bez změny genotypu a přežít s využitím již dříve nahromaděné genetické variability skryté v nepřekládaných, tudíž rychle mutujících oblastech genomu. Kvasinky nám jsou však evolučně přece jen poměrně vzdálené. Všechny by nás zajímala odpověď na otázku, zda by něco podobného nemohlo fungovat u něčeho nám bližšího – alespoň u hlísta nebo mušky octomilky.

Role proteinu teplotního šoku Hsp90 v evoluci

V řadě z nás stále přežívá představa evoluce jako náhodných postupných změn vedoucích k populační variabilitě, z níž se pak přírodním výběrem selektují jedinci, kteří mají v určitém konkrétním prostředí nejvyšší reprodukční potenciál. Paleontologie nám však přes všechny možné metodologické námitky naznačuje možnost evoluce, při které ve velice krátkém čase mohou vzniknout dramatické morfologické a fyziologické změny a po nich rychlá druhová (a nejen druhová) radiace. Díky molekulární genetice a vývojové biologii známe již více než deset let molekuly, které by se na tomto urychlení evolučních procesů mohly podílet. Jde o homeotické geny, které ve vzájemné koordinaci dirigují vývojové procesy během diferenciace většiny mnohobuněčných organizmů (mutacemi v genech pro tyto regulační bílkoviny je možné dosáhnout velmi výrazných změn tělních plánů).

Existenci odlišného mechanizmu rychlého vytváření dramatických morfologických změn naznačují výsledky pokusů z laboratoře Susan Lindquistové, jedné z nejvýznamnějších postav současné buněčné biologie, jejímž hlavním tématem jsou proteiny teplotního stresu a priony. Jako modelový organizmus byla pro experimenty tradičně použita muška octomilka, na níž byl zkoumán vliv mutací v neobvyklém proteinu Hsp90. Ten je mezi ostatními proteiny teplotního šoku unikátní v tom, že není využíván pro sbalování proteinů během proteosyntézy, popř. jejich opětné přebalení za denaturačních podmínek, ale svou hlavní fyziologickou funkci plní při buněčné signalizaci. Váže se na několik proteinů, které regulují buněčný cyklus a vývojové procesy v mnohobuněčných organizmech. Nestabilní konformace těchto bílkovin je nezbytná pro jejich roli molekulárních „přepínačů“. Role Hsp90 při přenosech signálu spočívá v tom, že se k těmto „přepínačovým“ molekulám opakovaně váže a zase se z nich uvolňuje, a přitom je udržuje ve tvaru, který je výhodný pro přenos signálu. Zdá se, že Hsp90 nerozpoznává konkrétní pořadí aminokyselin, ale spíše struktury společné pro řadu nestabilních proteinů (zřejmě částečně odhalené hydrofobní postranní zbytky některých aminokyselin).

Pokud je v buňkách za normální růstové teploty zastavena nebo snížena syntéza Hsp90, není ovlivněn (alespoň u kvasinek) buněčný růst ani metabolizmus – kompletně je však zamezen přenos signálu závislý na této molekule. Za podmínek, které způsobují obecné proteinové poškození, je pak Hsp90 přesměrován na nové cíle – částečně denaturované proteiny, které se po částečném rozbalení začnou podobat přirozeným vazebným partnerům. Vzhlem k jejich roli v regulaci signalizace a vývojových procesů a díky jejich citlivosti k podmínkám vnějšího prostředí se nabízí možnost, že Hsp90 může být jedním ze zdrojů morfologické a fyziologické variability podmíněné vnějším prostředím.

Některé mutace v genu pro Hsp90 jsou v homozygotní kombinaci smrtící, a proto se v laboratorních chovech udržují v heterozygotním stavu. Mezi těmito heterozygotními jedinci se překvapivě často vyskytují morfologické abnormality. Podobný stav je možné navodit přidáváním geldanamycinu – specifického inhibitoru Hsp90. Co narušuje normální ontogenezi u mušek s poškozeným Hsp90? Autorky nabízejí tři možnosti (viz rámeček 2).

Utíkej, jak můžeš, ale nedávej to najevo

Zdá se, že se autorkám podařilo objevit něco pro evoluční biologii mimořádně významného – přímé propojení evoluční změny se změnou vnějšího prostředí – a to konkrétním molekulárním mechanizmem. V buňkách vyvíjejícího se organizmu je vlivem stresu zaviněného změnou vnějšího prostředí sníženo množství aktivního Hsp90, a to tak, že se Hsp90 vyváže na částečně denaturované proteiny. Mutované formy cílových signalizačních molekul, jejichž změněná konformační stabilita je pomocí chaperonové aktivity Hsp90 normálně „pufrována“, pak vede během ontogeneze k novému fenotypu. Ten může být selektován působením vnějšího prostředí, a pokud je alespoň částečně výhodný, po čase se ze závislosti na snížené funkci Hsp90 vymaní (působením vnějšího prostředí) a organizmus tak získá novou vlastnost. Předpokládaná evoluční role Hsp90 by zřejmě spočívala ve zviditelnění skryté genetické (a potenciálně morfologické) variability, která se může při změnách vnějšího prostředí (kdy je po nových variantách „společenská poptávka“) fenotypově projevit a stát se selektovatelným znakem.

Výše popsaný scénář je možné parafrázovat jako další variaci na téma věty Carrolovy červené královny: „K tomu, abys zůstal na místě, musíš co nejrychleji utíkat.“ V evoluci asi spíš platí: Utíkej, jak můžeš (mutuj, jak se dá), v klidovém stavu to ale moc nedávej najevo (viz „pufrační“ schopnosti Hsp90 a možná i dalších příbuzných molekul). Pokud by však šlo do tuhého, ukaž, že jsi o několik kol napřed. (Přestaň „pufrovat“ konformační nestabilitu svých proteinů a změň se podle toho, jak daleko jsi domutoval. Máš šanci, že přežiješ, nebo že dokonce zplodíš více potomstva než ostatní „běžci“ a tvoje vlastnosti se stanou vkladem do vínku nového druhu.)

Krom tohoto příkladu se nabízí srovnání s kondenzátorem. Během času se může genom „nabít“ mutacemi (které však nejsou fenotypově viditelné vzhledem k stabilizačnímu působení HSP90 na konformaci proteinů). Za stresových podmínek, kdy se objeví mnoho buněčných denaturovaných proteinů a HSP90 „neví kam dřív skočit“, se najednou vše vybije. Objeví se dlouhodobě hromaděná a do té chvíle skrytá variabilita v primární struktuře proteinů, která se bez asistence Hsp90 projeví změnou konformace (trojrozměrného uspořádání) řady proteinů. Pokud takto získají nové vlastnosti bílkoviny regulující morfogenezi, můžeme pozorovat tvarové abnormality.

Scénář evolučních změn zprostředkovaných proteinem Hsp90 je přes významnou experimentální podporu vysoce spekulativní, na rozdíl od jiných evolucionistických spekulací však nabízí řadu testovatelných předpovědí a přímo vybízí k uskutečnění experimentů na dalších druzích organizmů a s jinými HSP-molekulami. Z kuloárů vím, že jedním z testovaných organizmů byl pes. Na první pohled překvapivý model, jestliže se však podíváme na obrovskou morfologickou rozmanitost jednotlivých plemen, naskýtá se otázka – co kdyby i zde svou roli sehrály „molekulární kondenzátory“?

Možná ve vás při čtení těchto řádek narůstá podezření, že ten, kdo to napsal, je zakuklený lamarckista vybízející k testování lamarckistických, nebo dokonce mičurinovských hypotéz o dědičnosti získaných vlastností, popř. o rozkolísaném fenotypu. Je pravda, že články z pera (či spíše počítače) Susan Lindquistové vedly k renezanci jevů, které se „genocentrickému názoru“, převládajícímu od padesátých let dvacátého století, nehodily do krámu. Za všechny je možné uvést jméno C. H. Waddingtona, který svými výsledky nezapadajícími do dobového interpretačního kontextu poukazoval na to, že ne každá výjimka potvrzuje pravidlo, ale naopak pravidlo relativizuje a eroduje. V loňském roce se v renomovaném časopise Trends in Genetics objevil komentář na dané téma, k jehož napsání byla z více než poloviny využita literatura pocházející z doby před rokem 1965. Historický kontext pozapomenutých epigenetických a evolucionistických koncepcí (i ve vztahu k výsledkům S. Lindquistové) popsal A. Markoš v knize Tajemství hladiny (viz Vesmír 79, 647, 2000/11). Chtěl bych jen vyjádřit své přesvědčení, že výše zmíněné molekulární mechanizmy umožňující dlouhé nabíjení a rychlé vybití evolučních „kondenzátorů“, navíc spřahující environmentální stres s razantní evoluční změnou, jsou jen špičkou ledovce. V nejbližších letech se po odtabuizování jednoho způsobu přemýšlení o evoluci můžeme dočkat velkých překvapení – a to nejen na poli prionů a proteinů teplotního šoku. Na minimální znalost živého celku ukazuje např. to, kolik zcela neznámých typů proteinů je nalézáno při sekvenačních projektech (nemluvě o tom, jak málo toho víme o těch známých). Dobrou ilustrací z oblasti prionů je obvyklý dotaz na přednáškách S. Lindquistové (alespoň podle jejích slov): „Jestliže do proteinových databází zadáte charakteristiku prionového proteinu, kolik podobných proteinů (rozuměj s velkou pravděpodobností zcela nových prionů) naleznete?“ Odpověď zní: „Desítky, v dosud zveřejněných (do května loňského roku) částech lidského genomu jde asi o 35 velice pravděpodobných sekvencí, z nichž některé patří mezi signalizační molekuly.“ Máme se tedy brzy na co těšit.