Prostorové zobrazení preparátů

Mikroskop i dalekohled slouží k pozorování objektů, které se lidskému oku jeví jako příliš malé, buď pro obrovskou vzdálenost od Země, nebo pro nepatrné rozměry. Mikroskop složený z objektivu a okuláru (tzv. kompaundní mikroskop) se zrodil na přelomu 16. a 17. století. Spolehlivě není znám ani rok vynálezu, ani jméno vynálezce podle jedněch historiků jím byl hvězdář Galileo Galilei, podle jiných holandští výrobci brýlí, otec a syn Hans a Zacharias Janssenové, o nichž se ví, že r. 1604 vyrobili dalekohled, údajně podle italského vzoru z r. 1590. O Galileově práci s mikroskopem svědčí zpráva z r. 1610, v níž se uvádí, že hvězdář obrátil dalekohled okulárem dopředu a pozoroval jím muší oko. Zprávy o Janssenovi možná vedly J. Keplera k tomu, že r. 1610 přisoudil vynález dalekohledu „jakémusi Belgičanovi“. Díky Keplerově Dioptrice alespoň s jistotou víme, že r. 1611 byl už kompaundní mikroskop na světě (kniha obsahovala jeho schéma). Nejasnosti kolem vynálezu dalekohledu a mikroskopu mohou souviset s tím, že z dobových zpráv často nevyplývá, o jakém přístroji se mluví (zda o mikroskopu, jehož okulárem je spojka, či o krátkém dalekohledu s rozptylkou).

Mikroskop vyrobený Janssenovými zvětšoval 60× a jejich krajan Jan Swammerdam (1637–1680) jím jako první uviděl červené krvinky. Koncem sedmnáctého století se do historie mikroskopie zapsal Antony van Leeuwenhoek z Leydenu (1632–1723), obchodník se suknem a zpočátku jen amatérský brusič čoček. Během svého života prý vyrobil na 500 mikroskopů, které měly po jedné silně zvětšující čočce. Rozlišovací schopnost jeho čoček překonaly kompaundní mikroskopy, až když J. J. Lister vynalezl achromatický objektiv (1829). Do té doby byl bezvýhradně přijímán empirický poznatek, který formuloval jeden z nejznámějších průkopníků mikroskopie, Angličan Robert Hook (1635–1703): Jestliže lze použít jedno zvětšovací sklo, je třeba dát mu přednost před mikroskopem s více čočkami.

Robert Hook publikoval r. 1665 traktát Micrographia o mikroskopickém pozorování rostlinných tkání a struktury minerálů. Ital Marcello Malpighi r. 1661 nalezl díky mikroskopu krevní kapiláry. Také pilný pozorovatel van Leeuwenhoek objevil mnoho mikroskopických objektů živé přírody, mimo jiné popsal chování lidských spermií. Přes tyto úspěchy byl vliv mikroskopu na vývoj biologie a medicíny v prvních dvou stoletích po objevu zanedbatelný. Interpretace mikroskopických pozorování se občas dostávaly na samou hranici absurdity ¹⁾ a kontakty mezi prvními mikroskopisty prakticky neexistovaly. Roku 1692 si R. Hook postěžoval, že kromě pana Leeuwenhoeka neví o nikom, kdo by používal mikroskop jinak než pro zábavu a kratochvíli. Po Hookově smrti se dokonce zdálo, že bude mikroskop zapomenut. Naštěstí v 18. století tento přístroj pronikl do kulturního života v Anglii jako atribut gentlemanů zajímajících se o tajemství přírody. Masová obliba této „hračky“ podpořila aktivitu konstruktérů a výrobců nových modelů. Všechny kompaundní mikroskopy však až do Listerova vynálezu achromatického objektivu trpěly vadami zobrazení, které byly příčinou mnohých artefaktů. Většina tehdejších vědců proto mikroskopickým pozorováním nedůvěřovala, a dokonce pochybovala o reálnosti zobrazovaných objektů. Anatom Bichat, který zavedl pojem tkání, ještě v roce 1801 tvrdě odmítal jakákoli mikroskopická pozorování.

Prostorové zobrazování

• Konfokální mikroskop. Nejprve se objevila rastrovací mikroskopie s Nipkowovým diskem, později laserová rastrovací mikroskopie, která kombinuje optiku s počítačovým zpracováním detegovaných světelných signálů (viz Vesmír 76, 616, 1997/11 a Vesmír 74, 504, 1995/9). Obě konfokální metody umožňují selektivní zobrazování rovinných řezů vzorkem, přičemž s kvalitními objektivy o numerické aparatuře blízké hodnotě 1,3 činí tloušťka optických řezů pouhé desetiny mikronu. Prostým přeostřováním mikroskopu lze pak vzorek prohlížet vrstvu po vrstvě. Ze série optických řezů uložených v paměti počítače můžeme sestrojit trojrozměrný obraz studovaného objektu. Jednotlivé optické řezy však také můžeme přes sebe jednoduše přeložit. Pak uvidíme studovaný objekt zobrazený s hloubkou ostrosti, která je zcela mimo technické možnosti obyčejného mikroskopu. Příkladem jsou mikrofotografie J. Reschiga otištěné v tomto čísle.
• 3D-mikroskop. Před sedmi lety publikovali Alan Boyde a Gary Greenberg popis poměrně jednoduché úpravy osvětlovací soustavy běžného optického mikroskopu, díky níž lze pozorovat objekty v procházejícím světle ve stereoskopické podobě. Nový 3D­mikroskop má dva osvětlovací zdroje, jejichž světelné svazky procházejí vzorkem z protilehlých směrů, šikmo vzhledem ke svislé optické ose přístroje (viz schéma). Ukazuje se, že šikmé osvětlení má vliv nejen na kontrast a rozlišovací schopnost mikroskopu, ale i na polohu obrazů těch částí vzorku, které leží mimo ohnisko. Při šikmém osvětlení přicházejícím z různých stran se neostré obrazy detailů, jež se nacházejí pod zaostřenou rovinou a nad ní, stranově posunou vůči ostrému obrazu referenční roviny. Mikroskop s dvojitým šikmým osvětlením tímto způsobem vytváří dva obrazy trojrozměrného objektu, které vykazují podobnou paralaxu jako obrazy promítané na sítnici pravého a levého oka při obyčejném pozorování skupin různě vzdálených objektů. Zbývá zajistit, abychom obraz vytvořený při osvětlení zleva pozorovali pouze pravým okem, zatímco levé oko uvidí pouze obraz vytvořený druhým paprskem (viz schéma). V mikroskopu pak spatříme trojrozměrný obraz předmětu, v němž snadno postřehneme, jaké je skutečné prostorové uspořádání jeho součástí. Mírně rozostřené obrazy mimofokálních rovin navíc leží zřetelně mimo zaostřenou referenční rovinu, kterou díky tomu vnímáme bez rušivého rozmazaného pozadí. Snáze v ní proto rozpoznáváme jednotlivé strukturní detaily.