Přírodní inzulin a jeho náhrady

První zmínky o cukrovce (diabetes mellitus) lze nalézt již v egyptském Ebersově papyru, jehož stáří se odhaduje na 5000 let. Na počátku našeho letopočtu popsali tuto chorobu také řečtí lékaři. Významný mezník v poznávání cukrovky spadá do roku 1889, kdy Minkowski a Mehring prokázali, že slinivka břišní produkuje neznámou látku, která řídí metabolizmus sacharidů v těle. Od té doby se otázkou cukrovky zabývala řada významných vědeckých pracovníků i praktiků. Zásadní průlom v této tematice je však spojen se jmény Banting, Best, Macleod a Collip.

V květnu 1921 se objevil na scéně 29letý chirurg Frederick Banting, který si po první světové válce otevřel ortopedickou ordinaci v kanadském Londýně. Malý počet pacientů mu zajišťoval měsíčně příjem pouze asi čtyři dolary, a proto se s ním jeho snoubenka záhy rozešla, a on se pak rozešel se svou praxí. Prodal veškeré zařízení ordinace a zvolil vědeckou dráhu – rozhodl se, že objeví látku, která ovlivňuje spalování cukru v organizmu. Požádal Univerzitu v Torontu, aby mohl dva měsíce o prázdninách používat laboratoř profesora J. J. R. Macleoda. Univerzita mu vyhověla a poskytla mu nejen finanční podporu (100 dolarů), ale i deset laboratorních psů a pomocníka – studenta medicíny Charlese Besta.

Jejich výzkum byl doprovázen stísněnými podmínkami v laboratoři, malým počtem pokusných zvířat, nedostatečnou biochemickou zkušeností, a hlavně nedostatkem peněz, času i důvěry pracovníků univerzity. Díky mimořádnému pracovnímu úsilí obou nadšenců se první pozitivní výsledky objevily již 27. června 1921. To je povzbudilo v práci. Spali v laboratoři, živili se vajíčky a uzenkami ohřátými na Bunsenově hořáku. Starou fordkou honili psy po chudinských oblastech Toronta a za dolar je kupovali od majitelů. A tak se téhož roku objevil první „isletin“ (Langerhansův ostrůvek slinivky břišní), který později Macleod přejmenoval na inzulin.

Macleod, který se vrátil v září 1921 z dovolené v Evropě, po jistém váhání poskytl k výzkumu další psy a přizval ke spolupráci biochemika J. B. Collipa. Výsledky společné práce zveřejnili v prosinci 1921, ale vědecká veřejnost je přijala s nedůvěrou. Rozhodli se proto podat další laboratorní důkazy o účinnosti inzulinu a rovněž prokázat, že získaná látka není pro lidský organizmus škodlivá. Banting a Best si vyhrnuli rukávy a jako první si vstříkli inzulin do těla. Události pak šly rychle za sebou. V torontské nemocnici, která stála naproti univerzitě, umíral v lednu 1921 na cukrovku čtrnáctiletý L. Thompson. Po aplikaci inzulinu se pacient rychle zotavil. Žil pak dalších třináct let (nezemřel na cukrovku, ale na následky dopravní nehody).

Po ověření účinnosti inzulinu se pocty začaly hrnout ze všech stran. Torontská univerzita udělila objevitelům cenu ve výši 50 dolarů. Parlament přiznal Bantingovi doživotní rentu 7500 dolarů. Banting a Best získali vedení vědeckých ústavů a v roce 1923 pak Banting s Macleodem obdrželi Nobelovu cenu, o jejíž finanční část se rozdělili se svými spolupracovníky Bestem a Collipem.

Průmyslové výroby inzulinu se r. 1922 ujala americká firma Eli Lilly, která má v této oblasti významné postavení dodnes. Později se začal inzulin vyrábět v Evropě v dánské Nordisk Insulin Laboratory a NOVO Company. V Československu byl inzulin poprvé podán pacientovi v roce 1923. Dnes je na našem trhu k dostání řada inzulinových preparátů, včetně výrobků firmy Léčiva.

V naší republice je registrováno téměř půl milionu diabetiků, přičemž jejich počet neustále stoupá. Uvádí se, že se cukrovka dostala na třetí místo příčin úmrtí na nemoci. Tato čísla jsou pobídkou, aby se otázkám stavby a působení inzulinu věnovala zvýšená pozornost.

Trojrozměrná struktura molekuly inzulinu

Inzulin je bílkovinný hormon molekulové váhy 5806. Jeho funkce je dána především chemickou strukturou, tj. složením bílkovinného řetězce z jednotlivých aminokyselinových zbytků, jak se r. 1958 podařilo popsat Sangerovi. Hovoříme o primární (sekvenční) struktuře. Ukazuje se, že primární struktura bílkovin určuje i jejich vyšší strukturní stupně. Tento takzvaný druhý genetický kód je součástí centrálního dogmatu molekulární biologie.

Molekula inzulinu se skládá ze dvou řetězců, řetězce A obsahujícího 21 aminokyselinových zbytků a řetězce B obsahujícího 30 aminokyselinových zbytků. Jednotlivé úseky obou řetězců vytvářejí šroubovice, resp. rovinné útvary. Tyto úseky definují sekundární strukturu dané bílkoviny. Jednotlivé typy sekundárních struktur mají zásadní význam, protože v některých případech plní funkci „zesilovačů“ určitých fyzikálních vlastností. Například šroubovice alfa vykazuje jasný elektrický dipól mířící ve směru její osy. Obdobně rovinné útvary typu beta mají tendenci se vzájemně propojit vodíkovými můstky do větších rovinných struktur např. typu skládaného listu nebo barelu apod. U inzulinu se podařilo prokázat, že řetězec A obsahuje dva úseky typu šroubovice alfa orientované antiparalelně a v prostoru vzájemně fixované do tvaru písmene U sulfidickým můstkem dvou cysteinů (Cys A6 – Cys A11). Obdobně řetězec B má charakteristické uspořádání do tvaru písmene V a obsahuje jednu šroubovici alfa a jeden rovinný řetězec.

Oba řetězce jsou pak vzájemně vázány dvěma sulfidickými můstky cysteinů (Cys A7 – Cys B7, Cys A20 – Cys B19) a tvoří tak konečnou trojrozměrnou strukturu molekuly. Toto uspořádání vytváří poměrně pevný molekulární útvar. Připomeňme si, že metodami rentgenové difrakce se podařilo analyzovat několik tisíc struktur bílkovin a najít tak jistá pravděpodobnostní pravidla pro vytváření vyšších struktur z dané struktury primární. To vedlo k optimistickým představám, že se nám podaří metodami počítačového modelování předpovídat trojrozměrné struktury bílkovin na základě znalosti sekvence reziduí. Za fyziologických podmínek se bílkovinná molekula svine do původní struktury během sekund či minut. Matematické modelování je proto zatím nedokonalé a představuje nesmírné množství výpočtů, jež se ukázaly jako úspěšné pouze v ojedinělých případech. Mluvíme o Levinthalově paradoxu, který srovnává naše snažení s dokonalými schopnostmi přírody. Toto platí i o poměrně jednoduché molekule inzulinu, jejíž trojrozměrnou strukturu určila až v roce 1969 D. M. Hodgkinová metodami rentgenové strukturní analýzy. Sama autorka uvádí, že ani vedení jejího pracoviště nevěřilo v úspěch projektu, a tak musela do jisté míry tajit, čím se vlastně zabývá.

Vyšší struktury inzulinu

Koncové aminokyselinové zbytky (Phe 24 a Phe 25) řetězce B mají tendenci tvořit čtyři vodíkové můstky se stejnými aminokyselinovými zbytky sousední molekuly. Tím vznikne lokálně struktura antiparalelně uspořádaného skládaného listu, která vytvoří poměrně stabilní dimer (útvar ze dvou molekul) inzulinu. Obě molekuly jsou vzájemně orientovány rotací podle pseudodvojčetné osy. Tři dimery mají za jistých podmínek tendenci vytvářet hexamer, který vykazuje trojčetnou symetrii, s osou kolmou na pseudodvojčetnou osu dimerů. Okolí trojčetné osy bývá v původním inzulinu obsazeno dvěma atomy zinku. V laboratorních podmínkách se pak podařilo připravit inzulinové monokrystaly, kde kromě zinku mohou být podél trojčetné osy i atomy chloru nebo vápníku, popřípadě kadmia. Ukazuje se, že inzulin je ve formě mikrokrystalů ve slinivce břišní. Z experimentů však vyplývá, že v okamžiku interakce s příslušným receptorem je inzulin patrně monomerní. Třírozměrná struktura inzulinového receptoru ale není doposud přesně známa. Proto existují pouze pracovní hypotézy, popisující vlastní proces interakce na úrovni jednotlivých aminokyselinových zbytků či funkčních skupin. Patrně zde hrají významnou roli i všudypřítomné molekuly vody, které svými elektrickými vlastnostmi mohou přispět ke správné orientaci, a posléze i k vazbě mezi molekulou inzulinu a aktivním místem inzulinového receptoru.

Modifikace inzulinu a inzulinová analoga

Jednotlivé biologické druhy produkují inzulin, který se od lidského buď málo, nebo více liší primární strukturou. Trojrozměrná struktura je však zachována vždy, což svědčí o jejím funkčním významu. Je zajištěna existencí invariantů, tj. úseků, které mají stejnou primární i sekundární strukturu, společnou všem typům inzulinů se zachovanou fyziologickou funkcí, bez ohledu na jejich původ. Nejblíž lidskému inzulinu je inzulin prasečí, který se liší pouze posledním reziduem v C-konci řetězce B, kde se místo „člověčího“ treoninu nachází „prasečí“ alanin.

Snahou mnoha výzkumníků je nahradit přírodní inzulin průmyslově připravenými preparáty speciálních vlastností, které by pacientům usnadnily svízelný život, doprovázený často přidruženými vážnými chorobami. Vedle změn v pořadí zbytků primární struktury se zkoušelo jednotlivé zbytky nahrazovat jinými, popřípadě je vynechávat. Cílem pokusů bylo obměnit vlastnosti takto uměle získaných látek. Odchylky od geneticky předávané stavby inzulinu se výjimečně najdou i u lidí, ale vždy se to projeví porušenou funkcí metabolizmu cukru.

Samostatnou skupinu tvoří analoga inzulinu připravená synteticky (resp. zčásti synteticky) s modifikacemi, které chrání molekulu inzulinu před předčasnou destrukcí vlastními enzymy a usnadňují interakci s inzulinovými receptory. ¹⁾