Životní minimum z pohledu bakterie

Evoluce je snad jedinou oblastí zájmu společnou všem biologům, protože nás zajímá, kde jsme se tu vzali. („Námi“ míním bakterie, sinice, řasy, prvoky, všeliké rostlinstvo, a v neposlední řadě živočichy včetně člověka.)

Od vědy ale nemůžeme čekat odpověď na otázku „odkud jsme přišli“. Nejlepší, v co lze doufat, je možný scénář událostí, na jehož počátku stojí sotva vychladlá anorganická Země a na konci svět, který známe, i s námi (chcete-li, Gaia): scénář, ve kterém se nevyskytuje nic, co by bylo v rozporu se známými fakty nebo se zavedenými a všeobecně přijatými modely přírodních dějů.

Hledá se „minimální život“

Nejproblematičtější částí takového scénáře je začátek: jak mohlo povstat živé z neživého? „Pouhá chemie“ mohla za zvláštních podmínek dát vzniknout peptidům a polynukleotidům, a přirozené vlastnosti takových molekul mohly být základem, z něhož vzešel prvotní, nepřesný genetický kód ²⁾ . Od vzájemně se překládajících organických polymerů, byť i uzavřených v abioticky vzniklém lipidovém měchýřku, je ale ještě daleko k životu, jak jej známe dnes...

Co je život? Pokusy o definici začínají i končí výčtem vlastností, které jsou organizmům společné. Takovou vlastností je především schopnost vytvořit víceméně přesnou kopii sebe sama. Protože vše živé se buďto skládá z buněk, nebo se aspoň neobejde bez buněk (také je vám proti mysli pokládat viry za neživé?), znamená to schopnost vytvořit z jedné buňky dvě. Pro proces, kterým se toto děje, se vžilo označení buněčný cyklus. Jedním z kritických bodů časného vývoje života je tedy vznik buněčného cyklu.

Buněčný cyklus, jak jej známe dnes, je značně složitá záležitost ³⁾ , protože buňka se musí starat

1. o to, aby se všechny její složky, od chromozomů až po lyzozomy, zdvojily jednou a právě jednou za cyklus,
2. o to, aby každá z dceřiných buněk dostala svůj podíl genetického materiálu, organel a ostatních vnitřních struktur v patřičném prostorovém uspořádání, a konečně
3. o spřažení růstu a dělení, tedy o to, aby se při opakování cyklu dceřiné buňky ani nezvětšovaly, ani nezmenšovaly.

V dnešních eukaryotních buňkách se na zajištění těchto funkcí podílejí desítky bílkovinných molekul propojených sítí vztahů. Buněčný cyklus „ve stavu zrodu“ musel být jednodušší; chceme-li se jej pokusit rekonstruovat, měli bychom vyjít ze studia co možná nejjednodušších organizmů. Snad by nám pomohlo, kdybychom nejprve našli odpověď na jinou vzrušující otázku: jaké funkce a struktury jsou nutné a postačující pro to, aby nejjednodušší představitelný organizmus přežil?

Můžeme spoléhat na bakterie?

Protože nejjednodušší buněčné organizmy jsou prokaryota - sinice a bakterie, znamená to vlastně definovat životní minimum bakteriální buňky. Při tom nám může pomoci skutečnost, že několik vybraných bakterií mělo to štěstí, že byly uznány za výhodné modelové organizmy, a tudíž se toho o nich dost ví.

Otázkou ovšem je, zda je jednoduchost dnešních prokaryot původní, nebo odvozená. Pravděpodobně to druhé: primitivní mikrobi byli sice jednoduší, ale jaksi jinak, než ti dnešní. Současná Escherichia coli nebo Bacillus subtilis například dovedou dělit své buňky rychleji, než mohou zdvojit jejich podstatné složky: buněčný cyklus rychle rostoucí E. coli trvá asi 40 minut, ale bakterie se v příznivých podmínkách dělí každých 20 minut! Dokáže totiž „pracovat“ na přípravě několika cyklů zároveň - buňka „babička“ již replikuje DNA pro svou „vnučku“. Je rozumné předpokládat, že primitivní předchůdci dnešních bakterií nic podobného neuměli a že jejich buněčný cyklus mohl být podobnější buněčnému cyklu jednoduchých eukaryot, jako jsou kvasinky, než cyklu dnešních modelových prokaryot. Snad v našich úvahách o životním minimu můžeme s dobrým svědomím kombinovat údaje získané studiem bakterií a studiem primitivních eukaryotních organizmů.

Životní minimum jako minimální sada genů

Jak vypadá nejjednodušší možný životaschopný organizmus? Jedním ze zásadních výdobytků klasické mikrobiální genetiky je formulace principu, vyjadřovaného tradičním schématem „jeden gen → jeden polypeptidový řetězec → jedna funkce“. I když bereme v úvahu příležitostné odchylky od tohoto pravidla (například geny kódující několik polypeptidů nebo bílkoviny s více funkcemi), dobrým měřítkem složitosti organizmu je počet genů. Hledáme-li bakteriální životní minimum, měli bychom hledat minimální sadu genů, která ještě stačí k zajištění všech životních funkcí mikrobiální buňky.

Jakmile však tento úmysl začneme uvádět ve skutek, nastanou potíže. Hledání genů metodami klasické genetiky je založeno na izolaci mutantů, u nichž se poškození (mutace) genu projevilo pozorovatelným způsobem. Kupříkladu porucha genu kódujícího enzym nezbytný pro biosyntézu aminokyseliny lyzinu se projevuje tak, že buňky se stanou závislými na lyzinu přidaném do média. Takovým způsobem ovšem lze zachytit pouze geny, které splňují následující požadavky:

1) Mutace nesmí buňku zahubit. S mrtvými buňkami genetik pracovat nemůže.

2) Mutace musí mít pozorovatelný projev (fenotyp).

Otázkou je, jaká část genomu tyto předpoklady splňuje. Hledání odpovědi na tuto otázku - i hledání mikrobiálního životního minima - by mohlo vyjít z „molekulární“ definice genů: organizmus jistě nemá víc genů, než má jeho genom otevřených čtecích rámců (ORFs) schopných kódovat polypeptidové řetězce.

V době, kdy tento text píši, je již známa úplná sekvence genomu dvou bakterií - kmenů druhů Haemophilus influenzae a Mycoplasma genitalium ⁴⁾ . Vyjdeme-li z velikosti genomu M. genitalium, který je menší než genom H. influenzae, můžeme s pocitem uspokojení, jaký obvykle poskytují jen velmi zjednodušené pravdy, prohlásit, že k životu stačí 482 genů!

Existují nezávislé organizmy?

Je ale skutečnost tak jednoduchá? M. genitalium není klasický modelový organizmus, u této bakterie zatím prakticky nebyla provozována klasická genetika a biochemické studie jsou v počátcích. Důkladněji prostudovaná E. coli má genů téměř desetkrát více. Přitom není příliš pravděpodobné, že by při své životní strategii, založené na rychlém množení, věnovala mnoho energie i času údržbě a replikaci genů, které nepotřebuje. Proč stačí naší sekvenované mykoplazmě tak málo genů?

Odpověď, kterou tušíme, je poněkud znepokojivá. E. coli se ve skutečnosti bez značné části svého genomu dovede obejít. Dokladem jsou dnes již stovky genů nalezených na základě „klasických“ ztrátových mutací, jako je třeba již zmiňovaná mutace způsobující závislost na lyzinu (lyzinovou auxotrofii). Ztráta těchto genů však má za následek zúžení prostoru podmínek, v nichž bakterie dovede žít. Chceme-li pěstovat E. coli auxotrofní na lyzin, musíme lyzin sypat do média. Chceme-li udržet při životě bakteriální kmen citlivý ke zvýšené teplotě, musíme se postarat o dobrou regulaci teploty v kultivační nádobě. S každou ztrátovou mutací se jaksi část životních funkcí převádí z bakterie na experimentátora, který se postupně stává čím dál tím podstatnější složkou systému... A teď si uvědomme, že M. genitalium se svými necelými pěti stovkami genů je parazit žijící pouze v lidském pohlavním a dýchacím ústrojí! Asi bychom náš uspokojivě zjednodušující výrok o objektivně zjištěném bakteriálním životním minimu měli formulovat poněkud opatrněji: k životu stačí 482 genů a teplokrevný hostitel.

A nejsme o moc dál, než jsme byli... Ale aspoň víme, že nelze spoléhat jen na velikost genomu. A připomněli jsme si jednu podstatnou věc: nemá smysl uvažovat o organizmech, a přitom ignorovat jejich okolí, jehož součástí jsou i další organizmy. Někdy ty další organizmy nejsou jen součástí okolí, ale okolím celým. Dáme-li si záležet, můžeme v přírodě vyhledat a vedle sebe seřadit řadu životních forem, které pokrývají celou škálu různých stupňů složitosti a různé míry nezávislosti na jiných organizmech. Zdá se, že od jistého bodu se jednoduchost a nezávislost navzájem vylučují, což,, poněkud komplikuje naše úsilí o hledání bakteriálního životního minima. Postupné zjednodušování nás vede od eukaryot k prokaryotům, od prokaryot k plastidům a mitochondriím - někdejším prokaryotním symbiontům, kteří se stali nepostradatelnými součástmi dnešních eukaryotních buněk, od mitochondrií - kam? Snad k virům, na něž můžeme pohlížet jako na osamocené sobecké geny, kterým zůstala jen starost o zachování vlastní identity (čili replikaci své nukleové kyseliny) a o oklamání buněčného hostitele, aby za ně převzal všechny ostatní životní funkce (čili infekčnost); a od virů k viroidům - skutečnému „symbolu genetična“ - parazitickým molekulám RNA, které se replikují a infikují hostitele, aniž by přitom kódovaly jediný protein. Můžeme ale pokračovat od mitochondrií i jiným směrem, přispívajíce svou troškou k nyní již téměř staleté diskusi o úloze epigenetických faktorů v utváření organizmu. Stačí uvědomit si, že existují kvasinkoví mutanti, jejichž mitochondrie vůbec neobsahují DNA, a přitom zůstávají mitochondriemi, i když nefunkčními (zůstává - a množí se! - struktura složená z fosfolipidů a z bílkovin kódovaných jadernými geny). Jak daleko je od takových mitochondrií k prionům, které lze prohlásit za „ztělesnění epigenetična“ - parazitickou konformaci hostitelských proteinů, která se dokáže s využitím buněčných mechanizmů šířit nejen po buňce, ale i z hostitele do hostitele? Očividně přitom jednoduchost extrémních forem života, jako jsou priony nebo viroidy, je „jiného druhu“ než jednoduchost našich primitivních předků. Hledáme-li životní minimum, které nám má pomoci při konstrukci možného scénáře vzniku buněčného cyklu (nebo buněčné organizace, protože tyto dvě události musely jít ruku v ruce), musíme si dát pozor, abychom při odhadu minimálního počtu genů skutečně vycházeli z co možná nezávisle žijících organizmů... ačkoli v přírodě není nezávislosti.

Bez zbytečnosti není života

Rozumným kompromisem je v této situaci volba modelového organizmu, který se dovede dobře obejít bez živého hostitele - jako je třeba E. coli nebo kvasinky (jsou sice eukaryotní, ale kvasinkový genom je jen asi třikrát větší než genom E. coli). Zvlášť důkladně prozkoumaná kvasinka Saccharomyces cerevisiae má navíc několik podstatných technických výhod. Její životní cyklus umožňuje práci s mutacemi, které by v haploidním stavu buňku zahubily, ale v diploidních buňkách je lze udržet naživu přítomností neporušené verze genu v druhé sadě chromozomů; tak lze obejít první vzpomínaný problém klasické genetiky. Metody genových manipulací navíc umožňují zavést cíleně mutace a sledovatelné značky (markery) do libovolného kvasinkového genu, jehož struktura je známa. To nás jednak zbavuje nutnosti omezit genetické studie na mutace s fenotypem, jednak poskytuje jedinečnou možnost přistoupit k hledání životního minima nikoli pozorováním, ale experimentální cestou: u každého jednotlivého genu lze dosti jednoduše zjistit, zda je pro život nezbytný. Protože úsilí o sekvenování genomu S. cerevisiae se blíží dokončení, téměř celý kvasinkový genom se stává přístupným takové analýze.

Poněkud překvapivě se ukazuje, že ztráta genu se u kvasinky fenotypově projeví jen asi ve čtvrtině případů (J. Pringle v této souvislosti hovoří o „paradoxu počtu genů“ - gene number paradox). Přitom životní styl kvasinek je dosti blízký tomu, který známe u prokaryot: čas od času přežití závisí na schopnosti rychle se namnožit. Proč tedy kvasinka udržuje ve svém genomu „zdánlivě zbytečné“ geny, jejichž mutace se nijak neprojeví? Jsou to geny, které jsou používány jen občas, ve zvláštních situacích, které v laboratoři neumíme napodobit, a po většinu života kvasinky jsou postradatelné? V takovém případě bychom je pro první odhad životního minima mohli zanedbat; pozoruhodnou shodou okolností je ta čtvrtina kvasinkového genomu, jejíž mutace má fenotyp, o málo menší než genom E. coli. Máme zde snad již lákavě jednoduchý způsob, jak dospět k odhadu velikosti minimálního genomu? Samozřejmě nemáme!

Je tomu právě naopak: podstatná část „genů bez fenotypu“ jsou právě geny, které v žádném případě zanedbat nesmíme: geny, jejichž funkce je tak životně důležitá, že si buňka nemůže dovolit ani to nejmenší poškození, a proto je má hned víckrát. Ne nutně jako kopie vzniklé duplikací jednoho původního genu. Takové případy známe - například ústřední regulátory eukaryotního buněčného cyklu, cykliny a cyklinem řízené kinázy, jsou produkty opakovaných duplikací a následného rozrůznění kopií několika málo původních genů. Členové vzniklé genové rodiny sice časem nabyli různých funkcí, ale do značné míry si zachovali schopnost vzájemně se zastupovat. Stojí za připomenutí, že jen jeden z deseti kvasinkových cyklinů byl nalezen na základě „klasické“ jednogenové mutace s fenotypem... Ale jsou i situace, kde buňka zajišťuje tytéž funkce několika různými způsoby, využívajíc strukturně nepříbuzné proteiny (stačí vzpomenout košaté soustavy transkripčních regulátorů, řídící expresi mnohých eukaryotních genů, třeba právě zmiňovaných genů pro cykliny).

Kybernetici už dávno vědí, že čím je systém složitější, tím redundantnější musí být, aby měl šanci na stabilitu; „zbytečnosti“ se stávají nezbytnou součástí systému. Při našem úsilí o nalezení mikrobiálního životního minima musíme brát ohled i na potřebné zmnožení základních funkcí. Tím se ovšem situace dál komplikuje. Vznik primitivní buňky, která obsahuje i záložní dráhy k zajištění základních funkcí v případě poruchy, se čím dál tím víc podobá pověstnému sestavení hodinek při náhodném třepání pytlem součástek.

Životní minimum závisí na okolnostech

Znamená to snad, že pokusy o sestavení přijatelného scénáře možného vzniku buněčného uspořádání a cyklu jsou odsouzeny k nezdaru? Věřím, že ne; a důvody k této víře mi dává několik skutečností.

Je dobře možné, že potřeba redundance roste se složitostí. V každém případě se složitostí tělesné stavby zřejmě roste minimální velikost genomu: hovoří se dokonce o „kvantovém skoku“ ve velikosti genomu na rozhraní mezi prokaryoty a eukaryoty (a možná i mezi nižšími živočichy a obratlovci, i když tam je situace daleko méně jasná). Jednoduché praorganizmy se mohly přece jen obejít bez redundance, zvlášť pokud si nedaly příliš záležet na přesnosti svého buněčného cyklu. I v současnosti se setkáváme s „organizmy“, kterým je celkem jedno, kolikrát za cyklus zreplikují svůj genom, pokud se to stane v průměru jednou. Mitochondrie mnohých rostlin replikují svou DNA způsobem, který produkuje řetězce pospojovaných kopií mateřské kruhové molekuly. Každá mitochondrie má mnoho „vydání“ svého genomu a jediné, na čem při dělení záleží, je, aby dceřiné mitochondrie dostaly aspoň jednu úplnou verzi genomu. Přesná segregace chromozomů je zde možná nahrazena kombinací statistického rozdělování velkého počtu kopií a pružné kontroly replikace, podobně, jako je tomu například u některých bakteriálních plazmidů.

Pro úvahy o počátcích buněčného cyklu je možná ještě zajímavější, že existují bakteriální mutace, které sice vážně poškozují regulaci replikace, kontrolu buněčného dělení, řízení segregace jednotlivých vnitrobuněčných struktur nebo spřažení mezi růstem a buněčným cyklem, ale přitom neohrožují životaschopnost buňky jako takovou. Jediné, co tyto mutace ovlivňují, je pravděpodobnost úspěšného dokončení buněčného cyklu. Vžitá představa, že buněčný cyklus produkuje dvě buňky z jedné, pramení z toho, že tomu tak je u většiny organizmů. Existují však i výjimky: u některých zelených řas vznikají v průběhu jednoho cyklu čtyři nebo dokonce 8 i více buněk. Obecně je počet zrozených buněk mocninou čísla 2 (tj. 2ⁿ), protože takovéto zvláštní cykly jsou vlastně výsledkem opakování několika „normálních“ cyklů se společnou cytokinezí; hovoří se o cyklech typu C_n, přičemž n je celočíselné a větší než 1. „Obyčejný“ buněčný cyklus je v takovémto formálním popisu cyklem typu C₁. Zmíněné cykly bakterií poškozených mutací by pak byly C_n cykly s 0 < n < 1. Lze si představit, že prvotní předchůdci dnešních prokaryot se s takovýmito cykly museli spokojit: úspěchem bylo už to, že pokus o rozdělení buňku nezahubil a občas dokonce vyprodukoval o buňku víc. Nepřesnosti vedoucí ke změně genetické výbavy dceřiných buněk přitom mohly být zdrojem dalšího materiálu pro evoluci: pokus o dělení mohl například některým buňkám ponechat část genomu navíc k evolučním experimentům.

Konečně je třeba připomenout, že vznik buněčného uspořádání sice musel být provázen vznikem buněčného cyklu, jak jej známe dnes, ale mezi těmito dvěma událostmi mohla uplynout značně dlouhá doba, kterou s trochou nadsázky můžeme označit jako „éru cyklů C₀“. Jinak řečeno: pro naše dávné předchůdce bylo úspěchem už to, že dokázali vzdorovat tlaku termodynamických zákonů a zachovat svou uspořádanost, obnovujíce neustále své struktury na účet energie z okolí.

Otázkou ovšem je, zda bychom našeho hypotetického prapředka, jehož obraz se na pozadí těchto úvah líhne - micelu naplněnou hromádkou oligonukleotidů a peptidů, která vzdoruje přirozenému rozpadu, příležitostně požírá jiné podobné i nepodobné micely, neustále mění svou strukturu a čas od času se třeba i rozdělí, vůbec poznali jako živého tvora...