Ako mrznú drevnaté rastliny

V prvom čísle 67. ročníka Vesmíru sa Václav Kůdela zaoberal problematikou poškodenia rastlín jarnými mrazmi v súvislosti s epifytnými baktériami. Zaujímavé sú aj nové pohľady na mechanizmy tolerancie opadavých drevnatých druhov voči zimným mrazom.

Na úvod mi však dovoľte niekoľko všeobecných poznámok k mrznutiu vody. Je známe, že voda zamŕza pri teplote 0 ^oC. Ak sú vo vode rozpustené soli, čo je aj prípad bunkových roztokov, bod mrznutia je nižší. Pri teplote nižšej ako bod mrznutia voda nezamrzne naraz celá, ale ľad sa začne tvoriť v tzv. nukleačných jadrách (v prípade bunky sú to napr. molekuly glykoproteínov). V neprítomnosti nukleačných jadier voda nezamŕza ani pri teplote mrznutia. Vtedy hovoríme o podchladení. Čistú vodu (bez rozpustených solí) možno podchladiť až na teplotu mínus 38 ^oC (homogénna nukleačná teplota vody). Pri nižšej teplote začne zamŕzať aj bez prítomnosti nukleačných jadier. Vodné roztoky v rastlinných bunkách sa dajú podchladiť na ešte nižšiu teplotu (okolo –45 ^oC). Pri mrznutí rastlín často dochádza k situácii, že v medzibunkových priestoroch sa vytvára ľad, ale voda v bunkách nezamŕza. Keďže tlak vodných pár nad ľadom je menší ako tlak pary nad tekutou vodou, medzi bunkami a medzibunkovými kryštálmi vzniká gradient tlaku pary.

Čitateľom, ktorí nie sú bezpečne zorientovaní v otázkach anatómie rastlín, ponúkam ešte krátky prehľad základných pojmov použitých v tomto článku. Vodivé pletivá rastlín sa rozdeľujú na drevo (xylém), ktorým sa transportujú vodné roztoky z koreňa do ostatných častí rastliny, a lyko (floém), v ktorom prúdia organické produkty fotosyntézy. U druhotne hrubnúcich rastlín vzniká drevo aj lyko v deliacom pletive kambiu. Súbežne s hrubnutím vodivých pletív vzniká aj druhotná kôra (periderm), ktorá je oddeľovaná deliacim pletivom (felogénom). Jeho činnosťou vzniká na povrchu stoniek a koreňov mnohovrstevné korkové pletivo (korok), ktoré sa napína, až napokon praská, odumiera a neskôr sa odlupuje. Je to tzv. borka. Felogén často oddeľuje parenchymatické (tenkostenné) bunky aj na svoju vnútornú stranu. V nadzemných orgánoch obsahujú tieto bunky chloroplasty a vytvárajú zelenú kôru (feloderm).

Podľa posledných názorov fylogenetikov, obranné reakcie proti mrazu sa začali vyvíjať už v čase vzniku prvých krytosemenných rastlín v horských polohách tropického pásma. Predpokladá sa, že tu práve vznikli prvé krytosemenné druhy. Na vznik obranných reakcií proti mrazu mohlo mať vplyv veľké kolísanie teplôt v tropických horách (s nočnými mrazíkmi do –5 ^oC a s dennými teplotami okolo 30 ^oC) a geneticky zakódované striedanie rastovej aktivity a odpočinku alebo aspoň periodické prerušovanie rastu. Obranné reakcie proti mrazu (a súčasne aj suchu) sa pravdepodobne ďalej zdokonaľovali s postupným rozširovaním rastlín do subtropických oblastí (s ojedinelými mrazíkmi a so striedaním obdobia dažďov a sucha).

Vďaka zdokonaleniu prístrojovej techniky sa podarilo v posledných rokoch získať najmä anglosaským, ale aj európskym výskumným pracovníkom niektoré konkrétne údaje o mechanizmoch, ktorými sa rastliny bránia pred zmrznutím. Pred slabými mrazíkmi (do niekoľko stupňov pod bod mrazu) sa chránia znížením bodu mrznutia bunečných roztokov, alebo častejšie – podchladením, resp. tvorbou podchladených roztokov. Podchladenie nemá trvalý charakter a využívajú ho rastliny s toleranciou voči mrazu do –5 ^oC. Smrť buniek nastane vtedy, ak sa v pletivách vytvorí ľad ako dôsledok intracelulárneho mrznutia, tj. ak vzniknú ľadové kryštály priamo vovnútri bunky. Obvykle sa totiž nevytvárajú v bunke, ale v medzibunkových priestoroch a medzi bunkovou stenou a protoplastom. Tento spôsob tvorby ľadu sa nazýva extracelulárny, nastáva pri ňom poškodenie alebo smrť buniek dehydratáciou alebo mechanicky. Stupeň tolerancie rastlín voči extracelulárnemu mrznutiu kolíše od schopnosti prežiť teploty blízko pod bodom mrazu až po teplotu tekutého dusíka (–196 ^oC).

Niektoré pletivá drevnatých rastlín, ako sú napr. dreňové lúče, pletivá semien alebo kvetných pukov stromov, zadržia po iniciácii mrznutia vodu proti gradientu tlaku pary a udržia roztoky v tekutom stave, aj keď sú hlboko podchladené. Bunky týchto pletív zostávajú často v stave hlbokého podchladenia i počas celej zimy.

Keď voda v podchladených pletivách začne mrznúť, uvoľní sa teplo, ktoré sa môže zaznamenať ako nízkoteplotná exoterma. Využíva sa nielen pri štúdiu spôsobov mrznutia pletív, ale aj na hodnotenie úrovne odolnosti voči mrazu diferenciálnou termálnou analýzou. Touto a ďalšími metódami, hlavne nukleárnou magnetickou rezonanciou, sa získali dôkazy o tom, že jednotlivé pletivá opadavých ovocných drevín a viniča mrznú odlišným spôsobom.

Mrznutie xylémových pletív (mrznutie dreva)

Nedávno sa zistilo, že dreňové lúče nezamŕzajú ako celé pletivá, ale v individuálnych jednotkách, prípadne v malých skupinách buniek. Pretože hlboké podchladenie vody je limitované teplotou –45 oC, je aj prežitie buniek limitované touto teplotou. Dosiaľ nevieme, ako sa môžu bunky v xylémových parenchýmových pletivách podchladiť až na takúto teplotu, keď je v priľahlých pletivách ľad. Bunky drevného parenchýmu by potom nesmeli obsahovať heterogénne nukleačné jadrá a museli by mať špecifickú schopnosť brániť prístupu ľadu z priľahlých pletív a premene bunkovej vody na extracelulárny ľad. Existuje hypotéza, že prenikaniu ľadu z priľahlých pletív bránia malé póry v bunkovej stene a permeabilita určitých častí bunkovej membrány. Nedávno boli uverejnenabilita určitých častí bunkovej membrány. Nedávno boli uverejnené prvé experimentálne údaje podporujúce túto hypotézu. V xylémových pletivách jednoročných výhonov jabloní sa nezistil ani špeciálnymi technikami žiadny rozdiel medzi bunkami vystavenými mrazom od –4 do –45 ^oC a tými, ktoré vôbec neboli vystavené mrazu. V hlboko podchladených jednoročných výhonoch jabloní sa nenašli intracelulárne ľadové kryštály ani po expozícii mrazu –45 ^oC, a preto ani praskliny pletív alebo známky kolapsu buniek. Kolaps a intracelulárny ľad vzniká, až ak sa pletivá ochladia na teplotu nižšiu ako –45 ^oC.

Mrznutie pletív druhotnej kôry

Spôsob mrznutia kôrových pletív je iný než xylémových. Doterajšie zistenia naznačujú, že voda v kôre mrzne extracelulárne, a že iniciácia ľadu začína pravdepodobne v extracelulárnych priestoroch. S rastom ľadových kryštálov vzniká gradient vodného potenciálu medzi extracelulárnym ľadom a intracelulárnym roztokom. Tento gradient spôsobuje pohyb intracelulárnej vody cez membrány do rastúcich ľadových kryštálov. S klesajúcou teplotou sa z buniek odsáva voda, objem buniek sa zmenšuje a zvyšuje sa koncentrácia bunkového roztoku. Pri tomto spôsobe mrznutia sa uplatňuje niekoľko mechanizmov, ktoré môžu spôsobiť poškodenie alebo smrť bunky: koncentrácia bunkového roztoku dosiahne toxickú úroveň, vovnútri bunky nastanú zmeny v hydrofilicko-hydrofobických interakciách alebo pokles aktivity vody spôsobí vyzrážanie proteínov.

V pletivách kôry vystavených silnému mrazu sa vytvoria ľadové kryštály, zredukuje sa objem buniek, nastane ich kolaps, a v dôsledku toho vzniknú trhliny a praskliny v bunkových stenách. Extracelulárne ľadové kryštály objavili v pletivách korku, kde sú najväčšie medzibunkové priestory, nezistili sa v pletivách floému a kambia, kde sú bunky nahustenejšie. Predpokladá sa, že odlišná reakcia rôznych typov pletív na silné mrazové stresy vyplýva z toho, že cesta, ktorou musí prejsť voda z buniek do rastúcich ľadových kryštálov, je u rôznych pletív rôzne dlhá. Okrem toho môže rozsah kolapsu buniek ovplyvniť vodný potenciál rôznych typov pletív.

Napriek zmenám v úrovni odolnosti začína tvorba ľadu v korku pri rovnakej teplote počas celej zimy. Zdá sa, že korkové pletivo nemá mechanizmus na tolerovanie mrazu, na otuženie ani na stratu otuženia po oteplení. Avšak feloderm, ktorý obsahuje parenchymatické bunky, takýto mechanizmus má. V bunkách felodermu sa pozoroval postupný rozpad vakuoly na niekoľko menších, pohyb jadra do centrálnej časti bunky a zmeny v štruktúre membrány. Dosiaľ však nie je jasné, do akej miery tieto zmeny priamo súvisia so vznikom odolnosti a do akej miery odrážajú zmeny spojené s dormanciou, umožňujúcou činnosť bunky pri nízkych teplotách.

Mrznutie kvetných pukov

V kvetných pukoch opadavých druhov drevín neprenikajú ľadové kryštály do všetkých pletív ale lokalizujú sa do šupín obaľujúcich puk a do pletív protiľahlých jeho osi. Tieto dve pletivá tvoria v puku akýsi sink pre kryštalizačné ľadové jadrá. Ľadové kryštály sa dosiaľ nepodarilo zistiť priamo v kvetných orgánoch puku dokonca ani pri teplotách blízkych letálnej úrovni.

Následkom tvorby ľadových kryštálov na dvoch miestach puku vznikne gradient vodného potenciálu v pletivách puku. Voda z kvetných orgánov puku migruje k rastúcim ľadovým kryštálom v šupinách a k pletivám protiľahlým osi puku, čím sa dehydratujú základy kvetných orgánov. Sakai nazval tento spôsob mrznutia “mimoorgánové″. I keď po silných mrazoch bunky kvetných orgánov odumrú, predpokladá sa, že je to skôr následkom dehydratácie než priamym zmrznutím. Takýto spôsob mrznutia je charakteristický pre puky väčšiny druhov drevnatých rastlín, ktoré vedia vyvinúť odolnosť voči zimným mrazom. Pravdepodobne disponujú mechanizmom schopným tolerovať extrémnu úroveň dehydratácie v priebehu “mimoorgánového″ mrznutia. Medzi jednotlivými druhmi drevnatých rastlín sú však rozdiely. Napr. vinič, ktorý má v jednom puku základy celého letorastu (os, kvetenstvá, listy a úponky), uvoľní pri mimoorgánovom mrznutí len časť vody z kvetných orgánov do rastúcich ľadových kryštálov. Zvyšná voda sa hlboko podchladí.

Samotné základy kvetných orgánov nemajú mechanizmus na toleranciu ľadových kryštálov. Ak už v nich kryštály pri silnom mrazovom strese vzniknú, preniknú rýchlo do celého pletiva a zahubia ho. Pri druhoch, kde sa z jedného puku vyvíja kvetenstvo s viacerými samostatnými kvetmi, ako napr. čerešne, višne alebo azalky, mrznú základy jednotlivých kvetov puku ako samostatné jednotky. V pukoch broskýň mrzne hlboko podchladená voda skôr, ako dosiahne homogénnu nukleačnú teplotu.

Dosiaľ známe elegantné mechanizmy, ktorými rastliny reagujú na stresy spôsobené silnými mrazmi, sú ovplyvňované špecifickými fyziologickými a anatomickými črtami jednotlivých pletív. Ich poznanie má nielen teoretický význam, ale je potrebné na vypracovanie včasných diagnostických metód na hodnotenie odolnosti jednotlivých druhov rastlín a ich pletív voči mrazu, čo je dôležité pri získavaní odolnejších odrôd či už klasickým šľachtením, alebo metódami génového inžinierstva.