Vědci a slepice

Z osobních vzpomínek žáků Milana Haška, působících ve významných vědeckých funkcích po celém světě, vznikla kniha Království tolerance (P. Ivanyi [ed.], Springer-Verlag, 1989). Haškovi žáci se sjeli na sympozium, uspořádané k uctění památky jejich učitele v Amsterdamu r. 1988. Nemusím snad připomínat, že sympozia se mohli zúčastnit jen ti, kteří žili mimo socialistické Československo. Připojený úctyhodný seznam publikací účastníků svědčí nejlépe o tom, že skutečně existovala pražská imunologická škola, která vycházela z prostředí plného oduševnění a tolerance, jež kolem sebe Milan Hašek (1925 – 1984) vytvořil. Pojem imunologická tolerance je spojen s jeho jménem. Také on, podobně jako Jan Svoboda (viz Vesmír 76, 425, 1997/8) měl blízko k Nobelově ceně, a také do tohoto příběhu se zamotala slepice.

Milan Hašek publikoval r. 1953 v časopise Československá biologie příspěvek prokazující „imunologické sblížení“ na základě experimentální parabiózy kuřecích embryí. Originální metodika spočívala ve spojení extraembryonálních krevních oběhů dvou kuřecích zárodků můstkem z kuřecí embryonální tkáně implantovaným na cévy plodového obalu. Tato tkáň proroste do dvou spojených vajec a umožňuje výměnu krve mezi zárodky. Oba extraembryonální oběhy ve vejcích potom zasychají, kuřata se normálně líhnou a krevní spojení se tak fyziologicky přeruší. Jedinci, kteří byli spolu uměle spojeni, pak v dospělosti navzájem netvoří protilátky při imunizaci krvinkami partnera. Reaktivita proti cizím krvinkám zůstává samozřejmě zachována. Téhož roku podal Peter B. Medawar experimentální důkaz imunologické tolerance, který předpověděl r. 1949 M. F. Burnet u myší. Nobelova cena pro oba vědce byla připravena už r. 1960. Nobelovská komise uvažovala i o Haškovi a pečlivě pročítala přeložený článek. Uznala, že pokusy, které provedl Hašek na modelu slepičích parabiontů, jsou nezávisle na Medawarovi důkazem imunologické tolerance. Haškova původní práce ale ještě nesla stopy mičurinské terminologie, která byla západnímu světu těžko pochopitelná. Podobně jako Svoboda, nedočkal se Nobelovy ceny ani Hašek, příčina však byla odlišná – v Haškův neprospěch rozhodla jeho intepretace výsledků. Chyba byla samozřejmě v (socialistické) ideologizaci vědy, nikoliv v Haškovi. Podrobnější údaje o historii objevu najdete v článku Tomáše Hraby, autora nad jiné povolaného, který patřil k Haškovým nejvýznamnějším spolupracovníkům (viz Vesmír 64, 234, 1985/4; 69, 288, 1990/5; 73, 308, 1994/6). M. Hašek samozřejmě brzy pochopil oč běží, a práce na problematice imunologické tolerance se rozběhla naplno. Logicky vyvstala potřeba geneticky dobře definovaného modelu, což Haška vedlo k tomu, aby obstaral vysoce inbrední linie slepic z Anglie. Z práce s tímto modelem se pak odvinula (mimo jiné) následující kapitola.

Význam inbredních zvířat (vzniklých příbuzenskou plemenitbou) pro experimenty ocenili genetici již počátkem století a nejznámější laboratorní zvíře (myš) slepici rychle předstihlo, vzhledem k přibližně čtyřikrát rychlejšímu reprodukčnímu cyklu. Na počátku 20. let již existovalo asi 250 myších inbredních linií (viz Vesmír 76, 208, 1997/4). Základ pro nejstarší inbrední linie slepic by položen na Univerzitě státu Iowa, a především v Národním drůbežářském ústavu v Reaseheath v Anglii v letech 1926 – 1936. Přímé potomky těchto linií, z nichž nejvýznamnější se stala linie C, chováme dodnes v Ústavu molekulární genetiky. Slepice tak představuje – vedle myši a potkana – nejlepší genetický model u vyšších obratlovců, který je o to vzácnější, že slepice je jediné hospodářské zvíře, u něhož byly založeny inbrední linie; je to také jediný zástupce třídy ptáků, a jak již bylo řečeno, k inbredizaci jsou zapotřebí desítky let.

Zatímco v Anglii prováděli u linie C selekci pouze na reprodukční vlastnosti, v tehdejším Ústavu experimentální biologie a genetiky (dnes Ústav molekulární genetiky) se koncem 50. let začala v rámci linie uplatňovat selekce na přežívání kožních štěpů a sérologickou identitu v krevních skupinách. V té době totiž D. Gilmour zveřejnil článek v Genetics ukazující, že u linie C přetrvává i po 25 generacích křížení bratr x sestra heterozygotnost právě v krevněskupinovém systému B, který byl postupně ztotožněn s hlavním histokompatibilitním systémem (MHC) u slepice.

Vývoj poznatků o slepičím MHC a rozvoj genetického modelu inbredních linií šly doslova ruku v ruce. S problematikou slepičího histokompatibilního komplexu spojil svůj osud Karel Hála, jeden z Haškových žáků, který se nejvíce zasloužil o zavedení prvních kongenních linií. Pomocí těchto linií mohl definovat první rekombinanty uvnitř MHC. Na základě výzkumu zvířat s rekombinovaným MHC jsme přistoupili k vytvoření příslušných rekombinantně kongenních linií.

Ty se staly východiskem pro pozdější molekulární analýzu, o kterou se zasloužil v počátcích hlavně Charles Auffray z Francie. Koncem 70. let jsme s Karlem Hálou započali se studiem úlohy MHC v zábraně progresivnímu růstu Rousových sarkomů u kongenních linií CB a CC a u nově založených rekombinantních linií. Tak se spojila dvě velká témata (virologické a imunogenetické) rozvíjená v našem ústavu.

Díky tomuto genetickému systému jsme mohli lokalizovat gen odpovědný za odolnost vůči zvětšování Rousových sarkomů do oblasti hlavního histokompatibilního komplexu označované B-F (viz text v rámečku), a přispět k objasnění imunitního základu této odolnosti.

K vyvolání nádorů u kuřat dnes využíváme specifické struktury DNA obsahující pouze virový onkogen. Vzniklý nádor neprodukuje virus a všechny nádorově specifické antigeny, které mohou být cílem imunity hostitele, jsou pod kontrolou samotného virového onkogenu.

Protože virové onkogeny vznikají strukturní přestavbou buněčných protoonkogenů, je možné, že alespoň v některých případech bude taková změna v kontextu s určitou molekulou hlavního histokompatibilního komplexu rozpoznána jako nový antigen. To dává obecnou naději na léčbu rakoviny u lidí. V „slepičím“ modelu studovaném na našem pracovišti se nám skutečně podařilo takovou závislost odhalit. Molekulárním přístupem již byla odkryta řada pozoruhodných vlastností slepičího hlavního histokompatibilního komplexu, o kterých snad někdy příště v samostatném přehledu. Tentokrát se této problematiky jen lehce dotkneme ještě v následující kapitole.

Ptačí genom představuje pouze asi 1/3 velikosti typického genomu u savců. Většina chromozomových párů (29 z celkového počtu 39) jsou mikrochromozomy. Na nich jsou vedle sebe natěsnány kompaktní geny s redukovanými introny. Uspořádání kódujících sekvencí genů naštěstí nebylo narušeno, takže je zajištěna homologie s produkty genů u savců. Ptáci snad přežili nějakou genetickou katastrofu, která vedla k fragmentaci a přestavbě genů tím, že si zachovali úspornou strukturu nejdůležitějších genů.

Takovou vizi předložil na základě syntézy mnoha experimentálních údajů nedávno Jim Kaufman, dlouholetý člen slavného imunologického ústavu v Basileji, který sám studoval především geny slepičího hlavního histokompatibilního komplexu. Hlavní histokompatibilitní komplex typického savce je velký genetický region, který kóduje mnoho molekul odlišné struktury a funkce.

Vlastní histokompatibilní komplex pak představují multigenní rodiny klasických transmembránových glykoproteinů třídy I a II, které vážou antigenní peptidy a předkládají je k specifickému rozpoznání T-lymfocytům imunního systému.

Nezměrná mnohotvárnost těchto genů je všeobecně dávána do souvislosti s evoluční soutěží mezi hostitelem a patogenem, z nichž první se snaží dosáhnout odolnosti vůči novým formám patogenu, které se naopak snaží vyvarovat imunity hostitelovy. Ve skutečnosti ale neexistují dobré příklady haplotypů (sad genů) hlavního histokompatibilního komplexu u savců, které by byly spojeny s výraznou vnímavostí k určitým patogenům. Je to pravděpodobně způsobeno velkou komplexností savčích MHC, takže se vždy v rámci jedné sady genů najde molekula poskytující větší či menší stupeň odolnosti.

je jednodušší a menší, mnohé sady genů mají pouze jeden dominantně exprimovaný gen třídy I a jeden gen třídy II;

u slepice je mnoho příkladů asociace sad genů MHC odolných vůči patogenům. Je možné, že tato odolnost je jednoduše předem dána vazebnou specifitou genů MHC, charakterizujících jednotlivé sady, pro peptidy odvozené z patogenních činitelů. To může platit zvláště v případě malých virů, které tak mohou přímo působit na výběr vhodných molekul MHC (u složitých patogenů je větší pravděpodobnost, že se vždy najde nějaký vhodný motiv).

První potvrzení těchto domněnek poskytl definovaný systém kongenních linií slepic CB a CC, z nichž první je odolná a druhá vnímavá k progresi nádorů indukovaných virem Rousova sarkomu. Na základě počítačové analýzy bylo zjištěno, že tento virus může poskytnout 17 různých oligopeptidů se strukturou přesně zapadající do molekuly MHC I. třídy (viz rámeček) v sadě genů B¹² u linie CB, zatímco pro sadu genů B⁴ u linie CC poskytne jenom 2 oligopeptidy.

Slepičí taktika jednoduchosti se uplatňuje také u dalších genů imunitního systému. U důležitých savců, tj. u člověka a myši, se imunoglobulinový repertoár tvoří kombinací řádově stovek funkčních genů (podrobněji viz Vesmír 73, 672, 1994/12).

Naproti tomu slepice má pouze po jednom funkčním genu V, který prochází přestvabou ve všech buňkách B.

V tzv. Fabriciově burze (speciálním centrálním lymfoidním slepičím orgánu) probíhá první tři týdny života čilé množení B buněk, z nichž se však pouze 5 % dostane do periferie. Většina prodělá apoptózu přímo v burze.

Průkopníkem studia slepičích imunoglobulinových genů je Claude-Agnes Reynaud z pařížského Institut Necker. Podobný mechanizmus byl později objeven také u savců – králíka a ovce. (Lymfoidními orgány asociovanými se střevem jsou zde takzvané Peyerovy plaky a appendix.)

Přestože slepice vytváří repertoár imunoglobulinů trochu jiným trikem než důležití savci, celkový proces vývoje imunitního systému je dost podobný. Celkově jednodušší genetická struktura všech imunologicky významných lokusů při vysoké evoluční konzervativnosti některých funkcí dělá ze slepice vhodný model.

Slepice, respektive její snesené vajíčko s vyvíjejícím se embryem, je jedinečným modelem, který umožňuje experimenty nemyslitelné u savců. Pro vývoj krvetvorných buněk je rozhodující primární mezenchym, který se u kuřecího embrya formuje v průběhu gastrulace ve stadiu primitivního proužku. Na rozdíl od savců, kde gastrulace vede k složité sférické struktuře, se u kuřecího embrya vyvíjí blastodisk, který je snadno přístupný experimentálním zásahům. Rovněž v pozdějších stadiích embryogeneze lze s úspěchem provádět mikrochirurgické zákroky. Důležité je, že embrya se mohou po takovém zásahu normálně vyvíjet, a líhnou se i životaschopná kuřata, na nichž můžeme sledovat vliv manipulací provedených v průběhu vývoje zárodku. Průkopnické pokusy, které do značné míry objasnily tkáňový původ meziproduktů různých vývojových řad krvinek a průběh kolonizace centrálních lymfoidních orgánů, kterými jsou thymus a Fabriciova burza, se zakládaly na mikrochirurgické konstrukci chimér kuře–křepelka. Pro identifikaci buněk byla využita distribuce chromatinu u jader křepelčích buněk, která je výrazně odlišuje od buněk kuřecího partnera. Využívá se i řada monoklonálních protilátek a k experimentům je možné využít přenos buněk u kongenních linií kuřat. Článek je o slepicích a vědcích, a tak bych chtěl připomenout alespoň dlouholetou systematickou práci Ústavu molekulární a buněčné embryologie v Nogent-sur-Marne poblíž Paříže a jeho vzácných osobností paní F. Dieterlen-Lievre a N.M. Le Dourain. Neméně významný je příspěvek manželů Auli a Pavo Toivanenových z univerzity v Turku ve Finsku.

Otázky vyzrávání krvinek v průběhu embryogeneze se kříží s problematikou některých onkogenů u tzv. akutních ptačích leukózových virů, které způsobují zablokování krvetvorných buněk na různém stupni vývoje. To vede k různým leukemiím, charakteristickým vyplavováním velkého množství určitého typu nezralých bílých i červených krvinek do oběhu. Je zajímavé, že kuřecí buňky jsou z nějaké příčiny zřejmě náchylné k infekci řadou leukemických a nádorových virů, což poskytuje prostor pro studium událostí v průběhu patologické krvetvorby. Rozbor mechanizmů, kterými tyto virové onkogeny transformují specifické krvetvorné buňky, poskytuje pohled nejen na příčiny leukemíí, ale také na fyziologickou funkci buněčných protoonkogenů v normální krvetvorbě. Zvláštní úlohu zde hrají teplotně senzitivní mutanty virových onkogenů (např. umožňují expanzi transformovaných buněk).

Významnou vlastností kuřecích buněk je jejich dlouhé přežívání v tkáňové kultuře, které je přibližuje, na rozdíl od myší, buňkám lidským. Po určitém počtu generací buňky stárnou a kultura zaniká. U kuřecích buněk je to až 40, lidské rostou 50 – 70 generací, zatímco myší jen 15. Když kultura stárne, začínají se objevovat mutanty, které pokračují v růstu neomezeně, získaly v podstatě nesmrtelnost. Takové nesmrtelné buněčné linie jsou u kuřete i člověka velkou vzácností, zatímco u myši se vyskytují pravidelně. Kuřecí buňky transformované některým leukemickým virem je tedy možné sledovat po dlouhou dobu v tkáňové kultuře v původním nemutovaném stavu, což má velký význam například pro sledování regulace exprese onkogenů apod. Studiem těchto otázek se systematicky zabývají T. Graf ve Virologickém ústavu v Heidelbergu a H. Beug v Ústavu molekulární patologie ve Vídni. Za oceánem pak Carlo Moscovici z Floridské univerzity.

Jedním z tradičních biomedicínských modelů jsou také tzv. obézní slepice. U nich byla popsána choroba připomínající lidskéautoimunitní onemocnění štítné žlázy – tzv. Hashimotovu nemoc. Typickým patologickým obrazem je rozvíjející se lymfoidní infiltrace štítné žlázy. Klinický obraz pak souvisí s porušenou funkcí tohoto životně důležitého centra produkce hormonů. Jde o chorobu podmíněnou více geny, z nichž jedním je i MHC. Výhodou slepičího modelu je, že ve srovnání s člověkem probíhá onemocnění jako by zrychleně, takže většina fází onemocnění se dá sledovat již v průběhu prvních měsíců života kuřete. U člověka bychom museli čekat mnoho let. Výzkumem modelových autoimunitních onemocnění u slepic se zabývá především Ústav experimentální patologie v Innsbrucku po vedením profesora Georga Wicka.

Několik vědeckých týmů na celém světě se snaží vyřešit problém umělého přenosu genů u slepice. Transgenní slepice by totiž mohly poskytovat produkty vnesených genů ve velkém – totiž ve vejcích. Například protilátky se do slepičího vajíčka dostávají způsobem, který odpovídá přenosu přes placentu u savců. Největší koncentrace je ve vaječném žloutku. Potíž s transgennímy kuřaty spočívá v tom, že prvních 24 hodin vývoje probíhá ve vejcovodu slepice. U myši se dnes už rutinně používá techniky mikroinjekce rekombinantní DNA do samčího pronukleu oplodněného vajíčka. To je u slepice nemožné. Slepičí vejce je oplodněno přibližně 30 minut po ovulaci. Buněčné dělení probíhá ve vejcovodu, takže při snesení vejce je embryo složeno přibližně z 60 000 buněk nazývaných blastoderm. Zatím nejnadějnější metodický postup spočívá v kultivování buněk z blastodisku sneseného vejce in vitro. Množící se zárodečné buňky se pak mohou v kultuře geneticky manipulovat a přenést zpět do blastodisku jiného embrya. Z takového vejce se vylíhnou chiméry. U některých z nich jsou také buňky zárodečné linie (pohlavní buňky) dvojího typu; tj. vedle buněk příjemce obsahují i buňky s vneseným genem. Pak už je jenom otázkou dalšího konvenčního křížení získat homozygotní jedince.

To vše se snadno řekne, ale hůř udělá. Problémem je např. zajistit in vitro patřičné růstové podmínky pro blastodermální buňky. Používají se proto třeba jiné buňky jako výživná podnož. Také byla již izolována řada specifických růstových faktorů, které se přidávají do kultivačních médií. Studium těchto faktorů již samo přineslo významné výsledky. Také u nás již běhají první kuřecí chiméry: v Ústavu živočišné produkce v Uhříněvsi v laboratoři Pavla Trefila. K jejich vytvoření přispěly geneticky definované slepice z Ústavu molekulární genetiky.

Spojení rozvinuté ptačí retrovirové technologie a snadné anatomické dostupnosti kuřecího embrya již od časných vývojových stadií nabízí další elegantní možnosti; pomocí replikačně kompetentního virového vektoru, např. s vneseným diferenciačním genem, je možná cílená expanze studovaného genu v určitých tkáních, jeho zvýšená exprese a vytváření nových oblastí působení jeho produktů. Tato metoda může být důležitým nástrojem k poznání genetické regulace vývojových procesů u obratlovců.

Jinou možnou cestu využití ptačích virových vektorů ukazují experimenty L. B. Crittendena a spolupracovníků. Rekombinantní leukózový virus, který se skládal z částí odvozených od patogenního viru a od neškodného endogenního viru, se podařilo zabudovat do zárodečných buněk linie slepic, které nemají vlastní endogenní virové sekvence. Vnesený provirus se stal nově děděným znakem a produkoval množství povrchového proteinu patogenního viru. Kuřata s tímto novým genem nebyla nijak postižena, naopak byla odolná proti infekci patogenními viry nesoucími stejný obalový protein. Vysvětlení spočívá v soupeření endogenně produkovaného proteinu s proteinem virovým o receptor, který je nutný pro přichycení a proniknutí viru do buňky.

Nedávno byla publikována první genetická mapa slepičího genomu. Využívá se v ní polymorfizmus signálních znaků molekul DNA. Tento přístup slibuje přinést užitek při analýze genů ovlivňujících produkční znaky, významné z hlediska produkce nebo odolnost vůči nemocem. Důležité jsou také informace týkající se konzervativnosti uspořádání genů na chromozomech u jednotlivých skupin obratlovců. Již se skutečně zdařila lokalizace mnoha klíčových genů významných pro srovnávací genové mapování s jasným vztahem k projektu lidského genomu. Slepice navíc může být vzácným objektem pro identifikaci genů přímou sekvenací genomu, protože má velkou hustotu genů, která je zvláště na mikrochromozomech pravděpodobně největší u obratlovců – 1 gen/10 000 bází. Konkurovat jí může v tomto směru pouze známá ryba fugu (viz Vesmír 75, 235, 1996/4). Široce založený program mapování slepičího genomu se rozvíjí pod vedením Nata Bumsteada v Ústavu zdraví zvířat v Comptonu (a je štědře dotován – dokonce v konzervativní Anglii).

Slepičí model přispěl k rozvoji takových biologických disciplin, jako jsou nádorová virologie a onkologie, imunologie, embryologie aj. Zdá se, že možnosti slepice nejsou zdaleka vyčerpány, včetně příslibů praktického využití transgenních jedinců pro výrobu různých biologicky aktivních látek ve vajíčku, či vytvoření odolných linií apod. Slepice, zvláště inbrední, ovšem vyžaduje jistou péči, potřebuje specializované chovatelské zázemí. Přeloženo do jazyka ekonomů: je poměrně drahá. Může nás tedy napadnout, zda nám slepice neubírá z již beztak skrovných prostředků na přístroje, chemikálie, zkumavky apod., které nezbytně potřebujeme. A v oblasti modelů je přece nejlevnější pracovat přímo na lidském materiálu.

A tak není vyloučeno, že i ty nejvzácnější linie nakonec zmizí ze světa ne kvůli nějaké chovatelské katastrofě třeba vlivem zavlečení infekční choroby, ale proto, že se dostanou mezi položky, na které prostě nemáme.

Dlouhodobé soužití vědců a slepic, zvláště některých inbredních linií, vedlo k nahromadění množství poznatků o fungování alel genů a jejich komplexů, v jistém smyslu fixovaných v příslušné linii. Inbrední linie představuje určitý vzorek, výsek normální populace, který ale v této podobě nikde jinde neexistuje – a který je samozřejmě také neobnovitelný. Nezasloužila by si Slepice laboratorní něco z prostředků věnovaných na tzv. ochranu genofondu hospodářských zvířat?