Vědci a slepice

Jako laboratorní zvíře použil slepici poprvé pravděpodobně Louis Pasteur. Jeho slepice musely podstoupit nedobrovolnou lázeň, zato se proslavily přímo na půdě Akademie lékařských věd v Paříži. Psal se rok 1878 a Pasteur zde demonstroval, že přirozená odolnost (imunita) slepic proti sněti slezinné je způsobena vyšší tělesnou teplotou, při které se původce nemoci (Bacillus anthracis) nemůže pomnožovat. Když totiž snížil teplotu slepic na 38 ⁰C částečným ponořením do vodní lázně, slepice onemocněly. Pasteur samozřejmě neopomněl odpovídající kontroly včetně slepice, která se sice koupala, ale měla se před učenou společností čile k světu, protože nedostala injekci zhoubného bacila a samotná lázeň jí nijak neuškodila. Tyto a další pokusy s mikroby cholery slepic oslabenými vzduchem vedly bezprostředně k vyslovení základních tezí o imunitě a k první vakcinaci.

Zde má slepice nespornou prioritu. Výzkum ptačích virů, které způsobují nádorová onemocnění, započal již v roce 1908. Dánští vědci Vilhelm Ellerman a Oluf Bang vyvolali pomocí bezbuněčného filtrátu z tkáně leukemických kuřat stejné onemocnění u jiných kuřat. Leukemie ovšem v té době nebyla jednoznačně klasifikována jako nádorové onemocnění, a tak jejich objev nevzbudil příliš velký ohlas. Muselo uběhnout téměř dvacet let, než transplantační studie u savců ukázaly, že se leukemické buňky chovají podobně jako buňky nádorů.

Podstatně větší vliv na výzkum virové etiologie nádorů měl objev bezbuněčného přenosu solidního nádoru, kuřecího sarkomu. V roce 1911 Peyton Rous prováděl první experimenty se spontánním nádorem, který objevil rok předtím. Rous měl v úmyslu prokázat, že pro úspěšný přenos je zapotřebí neporušených nádorových buněk, a tak pro jejich odstranění použil obyčejný filtrační papír. Bylo známo, že tento postup zabraňuje transplantaci savčích nádorů. K svému překvapení však u kuřat infikovaných filtrátem získal nádory. V následující sérii pečlivých pokusů nepochybně prokázal bezbuněčný přenos nádoru a potvrdil, že objevený kuřecí sarkom je skutečně maligním novotvarem, nikoliv pouhým infekčním granulomem. Přesto byl tento epochální objev přijat s nedůvěrou. Teprve r. 1933 Claude a Murphy v přehledném článku připouštějí pracovní hypotézu, že ptačí nádory jsou pravými neoplaziemi, a to již bylo známo kolem dvaceti transplantovatelných nádorů u drůbeže, které byly přenosné bezbuněčným filtrátem. Existence viru způsobujícího pravé rakovinové nádory, pokud ji vůbec někdo akceptoval, byla ovšem považována za výjimku, která nemá mnoho co říci k problematice rakoviny u lidí.

Částečně se nedůvěra v nádorovou virologii prolomila až po druhé světové válce, po úspěšné izolaci virů také z nádorů u savců, včetně primátů a člověka. Podrobnější výčet by byl nad rámec tohoto příspěvku, a tak připomeňme alespoň, že již v roce 1942 popsal J. Bittner virus přenášený mlékem (MMTV), který způsobuje karcinomy mléčné žlázy; L. Gross objevil r. 1951 virového původce myších lymfomů a leukemií (MuLV) a r. 1953 virus polyoma; na samém konci padesátých let a začátkem let šedesátých bylo prokázáno nádorotvorné působení opičího viru 40 (SV-40) a lidských adenovirů.

Mezi tím ale řada vědeckých nadšenců přispívala k pokroku ve výzkumu ptačích nádorových virů, a pozdější historie měla ukázat, že toto úsilí nebylo marné. Virus z původního Rousova sarkomu (RSV) se stal nejstudovanějším prototypem virů této skupiny, která si později vysloužila název retroviry, pro svoji poněkud obrácenou taktiku přenosu genetické informace (viz dále). Nejprve ale bylo potřeba postavit pevné metodické základy rozvíjejícího se oboru. Jedním z nepříjemných aspektů práce s ptačími sarkomy byla nestálost bezbuněčných preparátů. Filtrovatelnost se často úplně ztrácela a bylo nutno použít opakovaných pasáží buněčných transplantátů nádoru, než jejich extrakty znovu získaly charakter filtrovatelného agens.

Velkou nevýhodou byla nepřítomnost spolehlivé kvantitativní metody na stanovení viru v různých hostitelích. Těmito problémy se od konce čtyřicátých let systematicky zabýval W.R. Bryan, který největší měrou přispěl k vytvoření kmene RSV standardně produkujícího vysoké titry viru. Selekce spočívala na kladné korelaci mezi počáteční dávkou viru, rychlostí růstu nádorů a výtěžkem viru. Bryan zároveň zavedl biometrické metody pro analýzu odpovědi hostitele na infikování RSV. Kolem roku 1955 započal Harry Rubin se studiem interakcí RSV a hostitele na buněčné úrovni. První kvantitativní údaje o virové replikaci v buněčné kultuře byly získány z počtu nádorků vytvořených na chorioalantoidní membráně (obalu) kuřecích embryí. V roce 1958 pak spolu se svým bezpochyby nejúspěšnějším studentem Howardem Teminem vypracovali přesnou a spolehlivou metodu založenou na pozorování toho, že po infekci kultury kuřecích buněk virem RSV se vytvářejí diskrétní ohniska (fokusy) změněných buněk. Ty se pak dají dobře počítat po převrstvení kultivačním médiem s agarem. Tato metoda, známá jako fokální test, se stala východiskem pro mnoho dalších metod zaměřených na charakteristiku transformovaných buněk, které se používají dodnes. Pomocí fokálního testu mohly být rozlišeny směsné populace virů udržovaných již téměř padesát let v pasážích RSV na zvířatech i v buněčných kulturách. Nejdůležitější ale bylo, že indukce nádorů mohla být poprvé studována in vitro jako kvantitativní proměnná.

Ve stejné době se rozvíjel rovněž výzkum ptačích leukemických virů, který byl motivován ztrátami způsobovanými lymfomatózními onemocněními v drůbežářském průmyslu. Ve Spojených státech vzniklo na konci třicátých let centrum (dnes věhlasná Regional Poultry Research Laboratory v East Lansing ve státě Michigan) zaměřené na otázky studia ptačích leukóz. Již zpočátku zde kladli důraz na genetickou kontrolu rezistence k studovaným chorobám a rozvinuli široký program na vytváření inbredních linií slepic, který pokračuje do dnešních dní, samozřejmě obohacen o metodické přístupy molekulární biologie. Tyto inbrední linie přispěly významnou měrou k vytvoření solidního modelového zázemí pro výzkum nádorových virů.

Výzkum ptačích leukóz přinesl mezi jiným identifikaci původce ekonomicky nejzávažnějšího onemocnění drůbeže – Markovy nemoci. Je jím herpesvirus (MDV), který svými biologickými vlastnosti nijak nesouvisí se skupinou ptačích leukózových virů podobných RSV. Zásadní práci na toto téma publikovali A. E. Churchill a P. M. Biggs r. 1967 v časopise Nature. Tím byla odstraněna řada nejasností v etiologii navenek podobných onemocnění, kterým se říkalo komplex ptačích leukóz. Vyvinutí účinné vakcíny proti Markově nemoci s použitím krůtího herpesviru příbuzného MDV bylo o několik let později prvním příkladem úspěšné imunologické ochrany před nádorovým onemocněním.

Jiná skupina vědců, kterou vedl J. W. Beard, se soustředila na akutní leukemie projevující se u kuřat masivním výskytem nezralých leukocytů v krvi. Jeden z původců takového onemocnění, virus ptačí myeloblastózy (AMV), je schopen množit se do obrovských množství v plazmě infikovaných kuřat (10¹² partikulí/ml). Tak bylo možno izolovat téměř čisté preparáty a na jejich základě získat první spolehlivé údaje o fyzikálních, chemických a morfologických vlastnostech ptačích nádorových virů. AMV se později stal výhradním zdrojem reverzní transkriptázy (viz dále), která se stala klíčovým nástrojem molekulární biologie a biotechnologického průmyslu.

Koncem šedesátých let musel svět uznat, že nádorová virologie má své opodstatnění, že se rozvinula metodicky i teoreticky v samostatný obor, a tak byl i právem oceněn Peyton Rous a jeho dávno zvěčnělá slepice s nádorem No. 1 Nobelovou cenou za rok 1966. Padesát pět let, které uplynuly mezi zveřejněním objevu a udělením vrcholného vědeckého ocenění, je v biologii rekordem.

S vyřešením struktury DNA (J. D. Watson, F. H. C. Crick a M. H. Wilkins, 1953) a přečtením genetického kódu (M. W. Nirenberg a J. H. Matthaei, 1965) započala bezesporu nová epocha v genetice a v biologii vůbec. Nádorová virologie, postavená na solidním experimentálně biologickém zázemí, se nejen bez problémů připojila k tomuto mohutnému proudu, ale sama ho výrazně obohatila. Snaha poznat životní cyklus viru RSV a jemu podobných virů vedla bezprostředně k odhalení molekulárně biologického mechanizmu zásadního významu – RNA závislé syntézy DNA zvané reverzní transkripce a k identifikaci virových genů odpovědných za nádorový zvrat buňky – onkogenů. K odhalení tajemství retrovirů, jak byla skupina virů kolem RSV nazvána, přispěla na sklonku šedesátých let řada významných vědců. Snad nám prominou, když zdůrazníme zásluhy dvou výjimečných osobností: nedávno předčasně zesnulého Howarda Temina (1934 – 1994), dlouholetého profesora na Univerzitě ve Wisconsinu, a našeho Jana Svobody, současného ředitele Ústavu molekulární genetiky, kde prožil i většinu své vědecké kariéry. Oba zasvětili značnou část svého života studiu ptačích retrovirů.

Pro Temina byla v době jeho vědeckého vyzrávání velkou inspirací práce na modelu fága lambda. Zvláště ho fascinoval tehdy nový objev lyzogenie (dědičné schopnosti některých bakterií vytvářet fág za nepřítomnosti extrémních fágvých částic). A tak již od počátku šedesátých let nedala Teminovi spát myšlenka, že také RSV vytváří lyzogenní interakci s transformovanou buňkou. Představoval si, že RSV, jehož genom je tvořen molekulou RNA, může za jistých okolností produkovat svoji DNA kopii. To bylo tehdy naprosto kacířské mínění, vzhledem k čerstvě kanonizovanému tzv. centrálnímu dogmatu molekulární biologie, které postulovalo výlučný směr přenosu genetické informace ve směru DNA – RNA – protein. Teminova spekulace o DNA intermediátu v průběhu životního cyklu RSV se také setkala všeobecně se záporným stanoviskem. Změnu přinesl teprve objev enzymu – reverzní transkriptázy, která mohla být molekulárním nositelem předpovězených biologických procesů. Temin oznámil svůj objev r. 1970 společně s Davidem Baltimorem, kterého k izolaci reverzní transkriptázy přivedla tradice čistě biochemické školy. Druhá Nobelova cena pro ptačí retrovirology na sebe nenechala dlouho čekat a sdíleli ji v roce 1975 Howard Temin, David Baltimore a Renato Dulbecco.

V téže době, kdy Temin uvažoval o lyzogenní fázi RSV, formuloval již Jan Svoboda zřetelně své poznatky o stálosti virového genomu u savčích buněk infikovaných RSV (Nature 186, 980, 1960). Svobodovy experimenty navazovaly na tehdy nové poznatky, že některé kmeny RSV transformují také savčí buňky, což samo o sobě představovalo dobrou zprávu a pracovní stimul pro ptačí virologii, vzhledem k chronické nedůvěře vůči významu ptačího modelu pro biomedicínský výzkum. Svoboda započal svoji vědeckou dráhu u Milana Haška, spoluobjevitele imunologické tolerance (viz dále). Z toho vyplynulo zaměření prvních pokusů na studium tolerance k viru RSV a ovlivnění transplantability Rousových sarkomů mezi různými druhy ptáků. Hašek naproti tomu nebyl nikdy příliš nakloněn pokusům o přenos RSV na savce. Když Svoboda ještě jako student přece získal krysí nádor (XC) po infikování RSV, považovali to mnozí za experimentální artefakt. Svoboda vzpomíná, jak se ho (ředitel) Hašek ptal, co s tím chce dál dělat a kdy s tím skončí. Svoboda obhajoval svůj model tvrzením, že virový genom v buňkách krysího nádoru XC musí být odpovědný za genetické změny, které vedou k transformaci fibroblastů na nádorové buňky. Proto objasnění povahy tohoto virového genomu může poskytnout cenné informace o vlastní povaze nádorového zvratu buňky. Takové zdůvodnění se Haškovi zamlouvalo, a tak byla v tehdejším Ústavu experimentální biologie a genetiky otevřena cesta pokusům, které měly vyvrátit veškeré pochybnosti (podobně jako o půlstoletí dříve pokusy Rousovy).

V následujících letech bylo jasně doloženo, že buňky XC chovají provirus, který se pravidelně dědí jako buněčný gen. Krysí nádor XC vznikl jako důsledek ojedinělé události – infekce savčí buňky ptačím virem. Důležité ale bylo, že RSV je celkově neinfekční pro savčí buňky, z kterých se ani neuvolňuje. Tím byla vyloučena možnost, že virový genom, který transformoval buňky XC, by se mohl šířit novu infekcí. Později se ukázalo, že krysí a křeččí nádory vyvolané RSV uvolňují v některých případech malá množství viru, ale většinou se setkáváme s neproduktivním typem interakce, který Svoboda nazval virogenie. Virogenní buňky nesyntetizují infekční virus, ale intaktní RSV může být získán po injekci do kuřat nebo společnou kultivací či fúzí s kuřecími fibroblasty. V některých tzv. kryptovirogenních buňkách, v nichž nelze žádným z těchto postupů uvolnit virovou částici, je přítomen pouze virový onkogen src (viz dále, podrobněji viz Vesmír 66, 65, 1987/2).

Jasný experimentální průkaz trvání genomu RSV u savčích buněk silně nahrával myšlence jeho integrace do transformované buňky ve formě DNA proviru, a Jan Svoboda si toho byl vědom. Své mínění také vyjádřil již ve svých raných publikacích, které byly zveřejněny v renomovaných mezinárodních časopisech ještě před základními články Temina a ostatních. Na rozdíl od Temina, Svoboda správně předpokládal, že interakce neprodukující virus spočívá především v nepermisivitě (nesnášení infekce tímto virem) savčí buňky, nikoliv v defektnosti samotného viru. Svědčí o tom korespondence obou protagonistů, kterou Temin r. 1962 zahájil po přečtení Svobodova článku. Můžeme se tedy právem ptát, proč také Svobodovi nebyl přiznán podíl na Nobelově ceně r. 1975. Rozhodně to nemohla být chybná interpretace výsledků; ale byla již předznamenána doba, kdy sebedůmyslnější experimentálně biologický důkaz sám nebude mít dostatečnou váhu, bez definování molekulárních základů pozorovaného fenoménu. Je asi zbytečné hovořit o rozdílných podmínkách pro rozvoj molekulární biologie ve Spojených státech a v ČSSR v období normalizace po r. 1968. Je škoda, že jsme plně nevyužili tradičně velký potenciál naší experimentální biologie, díky kterému bylo připraveno jedinečné modelové zázemí pro řešení zásadních biomedicínských otázek na komplexní mezioborové úrovni. Lze jen doufat, že podobné postesknutí nebudeme muset za čas vyslovit také o současné době, která rozhodně není pro vědce – a pro slepice už vůbec – růžová.

Z experimentálního zázemí „slepičí“ virologie vedla přímá cesta k dalšímu fundamentálnímu objevu, k odhalení virových onkogenů odpovědných za nádorový zvrat buňky. K velkému překvapení se ukázalo, že tyto geny jsou buněčného původu a byly začleněny do virového genomu v průběhu životního cyklu viru. Za odhalení základních vlastností onkogenů byla r. 1989 udělena již třetí Nobelova cena v oboru retrovirologie. Podíleli se na ní Michael Bishop a Harold Varmus (podrobněji viz Vesmír 69, 133, 1990/3). V záplavě informací a jmen byli možná někteří další opět neprávem opomenuti.

Ale to už se naplno rozběhl další příběh s varovným podtextem, rozšíření aidsu. K rychlému odhalení retrovirového původce HIV a k nahromadění obrovského množství informace o jeho životním stylu mohlo dojít jen díky již připraveným metodickým postupům, které vypracovali „ptačí“ retrovirologové. Kdo bude nositelem již čtvrté Nobelovy ceny v oboru retrovirologie, to zatím nevíme. Je ale téměř nepochybné, že k tomu dojde brzy a že to komise opět nebude mít lehké. Jisté je jen to, že na slepici, která stála u zrodu, někteří již úplně zapomněli.