Využití kmenových buněk v regeneraci myokardu

V posledních letech jsme svědky velkého pokroku v léčbě nemocných s akutním infarktem myokardu. Příčinou vzniku této nemoci je postižení věnčitých tepen (koronárních arterií) aterosklerotickým procesem, vlastním mechanizmem, který nemoc vyvolává, je uzávěr věnčité tepny krevní sraženinou (trombem). Místo uzávěru tepny rozhoduje o tom, jaký bude mít infarkt vliv na další život nemocného. V nejhorším případě vyvolá uzávěr tepny poruchu srdečního rytmu (fibrilaci komor) a náhlou smrt. Pokud je nemocný s akutním infarktem myokardu v časné fázi rozvoje infarktu léčen optimálním způsobem, může být průběh onemocnění velmi příznivý. Používanou léčebnou metodou je dnes balonková koronární angioplastika, při které je v postižené tepně obnoven průtok pomocí balonkových katétrů. Princip této metody je velmi jednoduchý: skrz uzavřené místo ve věnčité tepně je zaveden nejprve velmi tenký drátek (vodič), po kterém se pak do místa uzávěru nasune speciální cévka (katétr) s válcovitým balonkem. Balonek má přesně daný zevní průměr (v milimetrech), jeho rozvinutí rozšíří průměr tepny a po jeho odstranění se v optimálním případě průtok v tepně obnoví. Do místa tepny, které bylo otevřeno, je dnes u většiny nemocných zavedena ještě kovová válcovitá pružinka (koronární stent), která je natlačena ke stěně tepny, a poskytuje tak podporu pro dlouhodobý dobrý průtok otevřenou tepnou. V České republice bylo v roce 2003 provedeno přibližně 6000 koronárních angioplastik v časné fázi akutního infarktu. V tom se řadíme na přední místa světových statistik a naše výsledky citují jako vzor přední kardiologické časopisy i v USA.

Přes uvedená příznivá data však víme, že část nemocných, kteří mají v akutní fázi infarktu myokardu úspěšnou koronární angioplastiku, ¹⁾ má přesto po výkonu postiženou funkci levé komory srdeční. Důvodů, které vedou k tomuto stavu, je více, na prvním místě je však pozdě provedené obnovení průtoku věnčitou tepnou. Nevratné poškození buněk myokardu totiž začíná již 15–20 minut po přerušení průtoku. Velikost infarktu ovlivňuje řada dalších faktorů. V nepříznivém případě dochází u těchto nemocných k časné přestavbě levé komory srdeční, charakterizované progresivním roztažením stěny komory v místě infarktového ložiska a celé levé komory. V dalším klinickém průběhu pak u takto postižené komory hrozí srdeční selhání. Standardní léčebné postupy přinášejí úlevu, ale nemohou obnovit funkci nevratně poškozených buněk srdečního svalu. Kromě farmakoterapie se v léčbě těchto nemocných v pokročilých fázích onemocnění využívají na specializovaných pracovištích mechanické podpory srdeční, elektrická resynchronizace srdečních stahů a transplantace srdce. Tyto metody je možné z řady důvodů použít jen u velmi malého počtu nemocných a jsou také velmi nákladné. Přestavba levé komory srdeční po infarktu myokardu s těžkým postižením funkce komory představuje u takto postižených pacientů jednu z hlavních příčin vzniku srdečního selhání a úmrtí. Přes využití postupů farmakologických, intervenčních a chirurgických a přes aplikaci nových mechanických podpor srdce nejsme schopni navodit proces regenerace poškozeného srdečního svalu. Novou naději představuje implantace kmenových buněk z kostní dřeně do oblasti infarktového ložiska.

Transplantace buněk u nemocných se ztrátou funkčního myokardu představuje proto novou léčebnou strategii, která má vést k regeneraci srdečních myocytů a k stimulaci tvorby nových cév v oblasti infarktového ložiska. Poznání, že si lidské tělo udržuje od narození populaci „rezervních“ kmenových buněk, které je možné později, během života, použít k regeneraci poškozených orgánů, je fascinující. Stejně jako embryonální buňky musí mít dospělé kmenové buňky některé vlastnosti, aby byly k regeneraci orgánů vhodné. Patří k nim schopnost vlastní obnovy po celou dobu života organizmu cestou asymetrického dělení (to znamená, že si jedna dceřiná buňka zachovává schopnost další multipotentní diferenciace – zůstává kmenovou buňkou – a druhá dceřiná buňka se specializuje do buněčného typu příslušného orgánu, včetně funkčních vlastností buněk tohoto orgánu). Úkolů, které tato buňka musí splnit, je více. Musí si sama najít místo, kde se dále bude dělit, tam si vytvořit správné kontakty s buňkami, které zde již sídlí, a začít se chovat funkčně jako buňka tohoto orgánu. Hledání potřebných kmenových buněk vychází z výsledků studia kmenových buněk z kostní dřeně.

Kmenové buňky

Využití kmenových buněk pro regeneraci různých orgánů vychází ze dvou základních vlastností primitivních kmenových buněk: kromě již zmíněné schopnosti vlastní obnovy je to schopnost diferenciace do různých buněčných typů, včetně buněk srdečního svalu (kardiomyocytů) a buněk cévních. Obnova srdeční a cévní tkáně probíhá přirozeným způsobem po každém jejich poškození, bohužel pouze ve velmi malém rozsahu. Bylo prokázáno, že u nemocných po akutním infarktu myokardu se zvyšuje hladina kmenových buněk v krevním oběhu, k dostatečné regeneraci je však těchto buněk málo. K intenzivní buněčné terapii je teoreticky možné využít několik zdrojů:

• embryonální kmenové buňky,
• buňky z kostní dřeně dospělých (hematopoetické a mezenchymální),
• myoblasty z kosterního svalstva,
• endotelové progenitorové buňky z cirkulující krve,
• kmenové buňky z jaterní tkáně,
• kmenové buňky z tukové tkáně.

Dosud byly pro regeneraci myokardu v humánní medicíně zkoušeny pouze dva typy buněk: ze svalů kosterních a z kostní dřeně.

Embryonální kmenové buňky

Tyto buňky je možné získat z vnitřní buněčné hmoty embrya ve vývojovém stadiu blastocysty nebo z pupečníkové krve. Diferencovat se mohou do všech typů buněk (jsou totipotentní). Přestože bylo prokázáno, že jsou schopny se diferencovat také na buňky srdečního svalu, není jejich využití v humánní medicíně možné z řady závažných důvodů. Kromě aspektů etických je to především obtížnost jejich získání, riziko různých imunitně vyvolaných reakcí včetně odhojování, možnost vzniku závažných poruch srdečního rytmu po transplantaci do srdečního svalu. Zatím se proto používají pouze v experimentech.

Svalové buňky z kosterního svalstva (skeletální myoblasty)

Jsou velmi odolné vůči nedostatečné dodávce kyslíku krví (ischemii). V experimentu bylo prokázáno, že se po jejich transplantaci do oblasti jizvy po infarktu srdečního svalu zlepší řada parametrů funkce levé komory srdeční. Předchůdce těchto buněk, satelitní buňky, lze získat z biopsie kosterního svalu a pomnožit kultivací ex vivo. V klinických studiích byly tyto buňky transplantovány do myokardu u nemocných po akutním infarktu myokardu s poškozenou funkcí levé komory srdeční, kteří podstoupili chirurgickou revaskularizaci srdečního svalu. ²⁾ V průměru bylo do 37 oblastí jizvy srdečního svalu injikováno 874 milionů buněk. Funkce myokardu se zlepšila již v období 2–3 měsíců po operaci a zlepšení přetrvávalo, jak ukázalo vyšetření za 12 měsíců. Přibližně 60 % postižených segmentů vykázalo při kontrole jistý stupeň kontrakcí, zlepšil se také subjektivní stav nemocných. Závažnou komplikací této strategie léčby byly po operaci poměrně časté závažné poruchy srdečního rytmu. Hlavním problémem při použití skeletálních myoblastů je totiž jejich neschopnost přeměny na funkční buňky srdečního svalu, netvoří se mezi nimi můstky, které jsou potřebné pro převod elektrických vzruchů. Vznikají tak ložiska elektricky izolované tkáně, která není schopna funkčního propojení se srdečním svalem příjemce. Tato ložiska mohou být zdrojem závažných poruch srdečního rytmu.

Buňky z kostní dřeně dospělých

Nejlepší možnost pro regeneraci myokardu je podle současných poznatků využití lidských buněk z kostní dřeně dospělých. Rozdělují se do dvou základních typů: na kmenové buňky hematopoetické, které se mohou diferencovat do řady buněčných typů, včetně endotelií (progenitorových buněk endotelu) a kardiomyocytů, a kmenové buňky mezenchyzmální, které jsou předchůdci buněk svalových, kostních a vazivových. Tyto buňky jsou tělu vlastní (autologní), odpadají tedy problémy etické a imunologické. Jejich transplantace po infarktu myokardu byla úspěšná u řady experimentálních zvířat – potkanů, králíků, psů, ovcí a prasat. Bylo prokázáno, že kmenové buňky z kostní dřeně jsou schopny se diferencovat na kardiomyocyty buď v prostředí buněk srdečního svalu, nebo působením 5-azacytidinu.

Způsoby aplikace kmenových buněk z kostní dřeně do myokardu

Autologní buňky z kostní dřeně (tj. pacientovy buňky) lze pro regeneraci myokardu po akutním infarktu získat buď odběrem z kostní krve, nebo mobilizací z kostní dřeně prostřednictvím stimulů.

• Odběr kostní krve se provádí klasickou punkcí, odebírá se 100–150 ml kostní krve, ze které jsou pak standardními hematologickými metodami izolovány mononukleární buňky. Počet těchto buněk v suspenzi je přesně znám, pohybuje se mezi 7–10 miliony, modernější separační vybavení umožňuje dosáhnout i významně větších koncentrací buněk v suspenzi. ³⁾ Odběr umožňuje získání kýžených buněk, jejich izolaci a navrácení do myokardu, k čemuž se používá několik metod:

  – Přímá injekce buněk do oblasti jizvy po infarktu myokardu během bypassové operace (intramyokardiální injekce). Tato technika byla dosud použita u malého počtu pacientů. V období 9–16 měsíců po injekci buněk nastalo symptomatické zlepšení u všech, u části se zlepšila tvorba krevních cév v tkáni infarktové zóny, u některých se zlepšila ejekční frakce ⁴⁾ levé komory.

  – Injekce buněk do stěny levé komory srdeční z dutiny komory (transendokardiální aplikace) speciálním katétrem během elektrického mapování povrchu srdečního svalu. Tato technika umožňuje vytvářet trojrozměrné rekonstrukce levé komory a je možné přesně rozpoznat hranice poškozeného myokardu. Tento postup je technicky náročný, hrozí vznik arytmií jak při mapování, tak při injekci buněk do myokardu. Publikovány byly výsledky již tří studií, v poslední z nich bylo touto technikou léčeno 14 nemocných s pokročilým srdečním selháním po infarktu myokardu, bez možnosti obnovení krevních cév v postižené tkáni. Při kontrolním vyšetření po čtyřech měsících byla funkce levé komory srdeční lepší než dříve.

  – Vstříknutí suspenze kmenových buněk přímo do věnčité tepny, jejíž uzávěr byl příčinou akutního infarktu myokardu. Tato metoda se v současné době využívá nejčastěji, především u nemocných v časné fázi po akutním infarktu myokardu.

  – Aplikace buněk kostní dřeně do žilního systému (intravenózní podání). Předpokládá se, že se buňky budou vychytávat především v místě, kde proběhl nedávno infarkt myokardu. Jejich přilnavost k těmto oblastem je zřejmě ovlivňována tím, že jsou v daném místě zvýšeně exprimovány růstové faktory a cytokiny. Tato možnost léčby byla zatím použita pouze v experimentu na myších s infarktem myokardu.

• Mobilizace buněk z kostní dřeně různými stimuly, například růstovými faktory nebo cytokiny. Mobilizované buňky je nutno přimět k pomnožení v cirkulující krvi a následně musí být vychytávány v místě postižené tkáně myokardu. Vychytávání je označováno jako „homing“ (usídlení) kmenových buněk. V experimentu byla tato metoda úspěšná pouze u myší, u opic byla v pokusné skupině vysoká mortalita.

Metody hodnocení úspěšnosti implantace kmenových buněk do myokardu

Výsledek usídlení buněk v tkáni jizvy po infarktu je možné sledovat jednak metodami, které hodnotí funkci a prokrvení srdeční komory, jednak přímým průkazem označených buněk v jizvě. Z hlediska funkčních změn byla ve studiích k hodnocení výsledku přenosu buněk použita řada metod. Patří k nim vyšetření levé komory srdeční ultrazvukem (echokardiografie) a vyšetření katetrizační se zobrazením velikosti a stažlivosti stěn levé komory po nástřiku kontrastní látky. K vyhodnocení průtoku krve srdečním svalem se využívá scintigrafie myokardu, metabolizmus je hodnocen pozitronovou emisní tomografií s 18-fluorodeoxyglukózou. V poslední době se při hodnocení funkce myokardu stále více uplatňuje také magnetická rezonance. Kombinace diagnostických metod umožňuje kvalitní posouzení funkčního i metabolického stavu myokardu po akutním infarktu i v dlouhodobém sledování.

Endotelové progenitorové buňky

Zárodečné buňky, ze kterých vzniká výstelka cévní (endotel), se tvoří v kostní dřeni. Za normálních okolností cirkulují v krvi a jsou schopny „opravit“ stěnu cévní v místech poškození. Bylo prokázáno, že u nemocných s koronární aterosklerózou je počet těchto buněk v krevním oběhu snížen. Podávání statinů (látek, které se používají k snížení cholesterolu v krvi) vedlo jak v experimentu, tak v klinické praxi k normalizaci počtu cirkulujících buněk. Klinické studie, které využívají endotelové progenitorové buňky pro navození tvorby nových cév v oblasti poškozeného myokardu, již byly zahájeny. Mechanizmy jejich stimulace a diferenciace in vivo nejsou známy. Stejně tak nejsou známy signály, které ovlivňují přesun těchto buněk a jejich usídlení v cílové tkáni.

Co už víme a co ještě ne

První výsledky využití kmenových buněk z kostní dřeně i endotelových progenitorových buněk u nemocných s postižením funkce levé komory po akutním infarktu myokardu jsou nadějné. V experimentu i v prvních klinických studiích bylo prokázáno, že kmenové buňky i endotelové progenitorové buňky aplikované do poškozeného myokardu jsou schopny zlepšit některé funkční parametry levé komory srdeční. Přesto musíme k možnostem jejich využití přistupovat s maximální obezřetností. Jde o zcela nové léčebné postupy, které sice využívají buňky tělu vlastní, ale v oblastech dosud v experimentu poměrně málo vyzkoušených, především na menších laboratorních zvířatech (experimentální práce na primátech jsou jen ojedinělé). Rychlý přechod do klinické medicíny je dán především dosavadní neutěšenou situací v léčbě nemocných s těžkým poškozením funkce levé komory srdeční při ischemické chorobě srdeční. Čeká nás období rozsáhlého experimentálního, ale také klinického výzkumu, ve kterém musí být zodpovězena řada zásadních otázek. Zatím nevíme, jakým mechanizmem kmenové buňky regeneraci myokardu navozují. Působí přímo vznik nově se tvořících buněk srdečního svalu? Podporují novou tvorbu kapilárního cévního řečiště? Nebo se pouze podílejí na produkci růstových faktorů působících v oblasti infarktového ložiska? Není s jistotou znám typ buněk, které budou v procesu opravy nejvýhodnější, nevíme, jak dlouho mohou zůstat funkční, zda nehrozí jejich zhoubné bujení. Není také dosud přesně určeno, kolik buněk máme používat, v jaké době po proběhlém akutním infarktu, jaké léky budou výhodné pro podpůrnou léčbu. Je důležité, aby použitá metoda snížila subjektivní potíže nemocných a umožnila dlouhodobé přežívání pacientů. Další otázky pak představují možnosti využít buněčnou léčbu u dalších klinických stavů, například při chronické ischemické chorobě srdeční nebo při dilatační kardiomyopatii (rozšíření srdce). Zvláště pro léčbu tohoto onemocnění by mohla být aplikace buněk vhodná, protože na rozdíl od fibrózní tkáně u nemocných po infarktu myokardu bychom zde mohli ovlivňovat funkci kardiomyocytů poškozených zcela jinými mechanizmy, například předchozím zánětlivým procesem.

Jsme tedy na začátku zajímavých možností výzkumu i léčebného uplatnění nových metod, které dávají určitou naději obrovskému počtu nemocných s chronickým postižením funkce srdce. Do pěti let budeme jistě vědět více a můžeme jen věřit, že cesta, po které jsme se vydali, je správná.