Chraňme svá muzea před hledači fosilní DNA

V době, kdy jsem přednášel medikům molekulární genetiku, používal jsem jako názorný příklad pro vytvoření představy o molekulách deoxyribonukleových kyselin (DNA), zchumlaných v lidských chromozomech, srovnání se špagetou nataženou přes celou délku Václavského náměstí. Příkladu by se z fyzikálně-matematického pohledu dala vytknout jistá nepřesnost. Je-li skutečná tloušťka vlákna DNA – dvojité spirály antiparalelně uložených a navzájem vodíkovými vazbami spoutaných řetězců – cca 2 nm a délka její molekuly v nejdelším z lidských chromozomů cca 10 cm, může si každý čtenář změřením špagety a Václavského náměstí sám ověřit, jakého zkreslení jsem se dopouštěl. Otázku srovnání mechanické pevnosti špagety s vláknem DNA by bylo rovněž možné podrobit kvalifikované kritice. Uvedeným příkladem jsem se pokoušel zdůraznit, jak je obtížné při různých manipulacích s molekulami DNA, např. při jejich izolaci, uchovat je v jejich přirozené délce. Je to téměř nemožné a i při šetrné práci získáváme DNA roztrhanou na spoustu kratších kousků. Většinou jsme s touto skutečností smířeni a pravda je, že pro běžnou práci s DNA nám to ani příliš nevadí. Vždyť i celé geny se mohou vejít do úseku kratšího než 1 000 bází.

Pokud je zpřetrhání na závadu, byly vypracovány techniky založené na tom, že DNA nevyjímáme z jádra, ale naopak zalitím buněk do síťoviny agarózového gelu ji před násilnými pohyby chráníme. Necháváme ji uzavřenou v klícce jaderné i buněčné membrány a dotýkáme se jí otvory v ní přítomnými.

Zub času a DNA

Celistvost DNA neohrožuje ovšem jen hrubé zacházení, ale číhá na ni i řada enzymů, které mají štěpení DNA přímo v náplni své práce. Protože pro svou činnost potřebují např. hořečnaté ionty, snažíme se je z jejich blízkosti odstranit. Stane-li se naopak naším cílem rozbití molekul DNA, účinnými nástroji je ultrazvuk, kyselé prostředí a DNA-ázy.

Kdo někdy izoloval DNA a ukládal ji tak, aby ji mohl v případě potřeby znovu použít, jistě došel časem ke zjištění, že je nevypočitatelná z hlediska své výdrže. Některou DNA mohl i po několika letech použít tak, jako by byla zcela čerstvě připravená, jiná se mezitím rozpadla a stala se zcela nepoužitelnou i pro poměrně nenáročné práce. Bylo vykonáno mnoho pokusů, které měly za cíl nalézt příčiny jejího rozpadu a nejšikovnější způsob jejího uchovávání. Ukázalo se, že výsledek nebývá vždy úměrný péči, kterou jí věnujeme. Někdy vydržela déle a v lepším stavu ta DNA, se kterou jsme zacházeli vysloveně nedbale. Kupodivu i po několika letech měly některé vzorky DNA dobrou kvalitu pro laboratorní práci. Problémy můžeme mít s jejím vyschnutím – „suchá“ DNA se velice obtížně rozpouští. A protože s DNA se pracuje nejméně dvacet let, mohli bychom v laboratořích najít vzorky, které tuto dobu přečkaly v dobrém stavu (pokud nebyly dávno spotřebovány).

Pochopitelně zdrojem DNA mohou být jak čerstvé tkáně, tak tkáně „mrtvé“. V odumřelých tkáních je DNA za normálních okolností rychle rozrušena – jako ostatně všechny buněčné součásti – lytickými procesy. Za určitých okolností jsou však tyto rozkladné, většinou enzymatické, procesy zabrzděny, někdy zcela zastaveny. Ze způsobů samozřejmých každému čtenáři je to především zchlazení, známé i z přírody (horské a jeskynní ledovce, sibiřský věčný led atd.) nebo vysušení (mumie). Další způsoby známe třeba z muzeí, kde jsou těla živočichů chráněna před rozkladem chemicky. Ukázalo se, že v těchto případech zůstává i DNA víceméně neporušená a lze ji izolovat a zkoumat, a tak se stala lákavou otázka, zda nám dochované zbytky dávno mrtvých těl mohou poskytnout i svou DNA ⁴⁾, ⁵⁾ a zda se z této DNA budeme moci něco dozvědět o jejich vlastnostech. Na tomto místě si můžeme udělat přehled úspěšných pokusů proniknout do minulosti analýzou DNA získané z objektů, které se do našich dob uchovaly ve stavu příznivém pro její trvanlivost.

Je „fosilní“ DNA skutečně původní?

Izolace DNA je prvním krokem, který musí zvládnout ten, kdo chce jejím prostřednictvím pátrat v minulosti života, a nebyl by mu příliš užitečný, kdyby neměl k dispozici další techniku, za niž vděčíme nositeli Nobelovy ceny K. B. Mullisovi, techniku umožňující množení molekul DNA, nebo přesněji jejich úseků – řetězovou polymerázovou reakcí zkratkou PCR. Pomocí této techniky se vybraný úsek DNA množí cyklicky se opakujícími reakčními fázemi tak, že každým cyklem se jeho množství zdvojnásobí. Abychom získali pro další analýzy potřebné množství DNA, musíme použít tím více cyklů, z čím menšího množství vycházíme. A taková je také většinou situace, která nastane, když analyzujeme „fosilní“ DNA³⁾. PCR nabízí i jistou výhodu v tom, že nejlépe množí úseky krátké, tedy takové, které vznikají postupně rozpadem DNA. V této situaci se ovšem vystavujeme i vážnému riziku. Práce s PCR ukázaly, že DNA je i tam, kde bychom to nikdy nepředpokládali, je v podstatě všudypřítomná. Všichni, pro které je PCR veleužitečným nástrojem při jejich práci, znají problémy s tzv. kontaminací, tj. přimísením cizí DNA k analyzované. Kontaminující DNA je nejen přítomna v podobě bakterií, plísní, pylu, ale nejzákeřnějším zdrojem je sama laboratorní práce, při níž se DNA zkoumá. Malé zkumavky, které se většinou v těchto laboratořích používají, se chovají jako láhve šampaňského a při jejich otevření se v podobě neviditelného aerosolu dostane do vzduchu část jejich obsahu. Snadno se nám přihodí, že úspěšně namnožíme i NIC, namnožená DNA se objeví i v těch zkumavkách, do kterých jsme nepřidali žádnou DNA, ale pouze destilovanou vodu.

Kontaminovány mohou být ovšem i samy zpracovávané vzorky, a to nejen již zmíněnými mikroorganizmy, které v nich mohly být přítomny už jako původní součást, nebo zkontaminovaly vzorek dodatečně, ale v případě muzejních sbírek mohla být cizí DNA zanesena při jejich úpravě a ošetřování.

Úspěšnost analýzy fosilní DNA je však zpochybňována hlavně apriorní nedůvěrou v možnost existence DNA v analyzovatelné podobě, tedy v plynulých úsecích dlouhých alespoň několik set nukleotidů, zvláště ve vzorcích starších několika tisíc let.⁷⁾. Experimentálně není totiž jednoduché výdrž DNA ověřit, nemůžeme důsledně napodobit podmínky, za kterých se nám fosilní DNA uchovala. Skutečností je, že zcela jiné vlastnosti má z tohoto hlediska DNA hydratovaná – ve vodném roztoku – než DNA vysušená – viz alchymistickou poučku „corpora non reagunt nisi liquida“. Dobře je také známá její citlivost, zvláště pyrimidinů, na krátkovlnné (ultrafialové) záření. Ačkoliv na úrovni samotných bází je stabilitou předčí puriny, pro celistvost řetězců jsou slabým článkem. Projev křehkosti vláken DNA je přímo úměrný jejich délce. Také proto se zájem soustřeďuje na přirozeně malé molekuly DNA (kromě dalších důvodů), jakými jsou DNA mitochondrií. Ve fosiliích najdeme opravdu většinou jen krátké kousky DNA, „suché“ DNA (rozpustnost je přímo úměrná krátkosti), která často byla uložena tak, že byla chráněna i před dalšími nepříznivými vlivy (např. před zářením).

Proč nás fosilní DNA tak zajímá?

Beze všech okolků připusťme, že ze zvědavosti, která je hlavní pohnutkou výzkumné činnosti vůbec. Jistě také z vědecké ctižádostivosti, ačkoliv nepůjde o zápis do Guinnessovy knihy rekordů – kdo najde nejstarší DNA. Konkrétní důvody budou asi tyto:

Analýza fosilní DNA nám totiž umožňuje použít získané výsledky k ověření představ o  makro- a mikroevoluci, a  to na  její základní úrovni – na  úrovni genetických informací. I  když nejspíš nezjistíme, jak se jednotlivé druhy zvířat nebo rostlin žijící na  zemi před miliony let lišily navzájem, na to je dostupných zbytků příliš málo, můžeme porovnávat minulost se současností. Lze třeba porovnat „pratermití“ DNA s DNA současných termitů a ověřit si hypotézy o vývojové proměnlivosti. Význam pro sledování vývoje lidstva a jeho  pohybů po  zeměkouli není ani třeba zdůrazňovat^{2) 8)}.

Lákavé by bylo hledat ve fosiliích odpověď na otázku vývoje genetického aparátu, ale v hloubce minulosti, kam se dokážeme ponořit, byl již vývoj genetického informačního systému natolik stabilizován, že nejspíš odpověď nezískáme. Snad bychom mohli získat nějaké poznatky o využití genetického kódu. Pohnutek ke zkoumání fosilní DNA by bylo možné vyjmenovat mnohem více a věnovat se jim podrobněji. Na tomto místě a v této chvíli se spokojíme nahlédnutím do pootevřených dveří, do kterých nyní ruku v ruce vchází antropologie s paleontologií.

Kde hledat?

Jak už jsem naznačil v názvu a jak vyplynulo z přehledu uveřejněných nálezů, není nutné cestovat na Sibiř nebo do Egypta, byť by to přispělo k dobrodružnosti takového výzkumu.

Velice cenným zdrojem DNA vyhynulých organizmů se staly muzejní sbírky. Leckterá muzea mají dokonce obavy, aby některé vzácné exempláře nebyly doslova rozebrány na kousky. Máme tedy i v tomto jistou nezaslouženou výhodu v relativní zaostalosti; přesto ale nebudu prozrazovat, jaké hmyzí zbytky v jantaru uchovává naše Národní muzeum, ani další rarity jeho sbírek. Ne že bych se obával, že by se někdo u nás chtěl pokusit vytvořit náš český jurský park, nemáme totiž vhodný ostrov. Nebojím se toho, že by si někdo mohl stvořit vlastního žaboještěra. Jisté a nezanedbatelné nebezpečí tu však bude.

Mé obavy se netýkají ohrožení muzejních sbírek, ale jsou docela obecné. Dovedeme-li dnes manipulovat s genomy virů a bakterií, ba dokonce i kvasinek, a naše schopnosti stále vzrůstají, nebude možné nikomu bránit (chybí nám příslušná legislativa), aby se pokusil rekonstruovat genomy dnes již neexistujících mikroorganizmů nebo jejich DNA použít k doplnění současných genomů, či obráceně. A nespokojíme se s genomy malými a jednoduchými. Bariéry, které např. bránily vědcům pokoušejícím se o mezidruhové křížení, již tak striktně na úrovni DNA neplatí, dokladem čehož jsou např. transgenní myši. I bez fantazie, jen na základě pouhé kalkulace, můžeme předpovědět, že naše dovednost bude nadále vzrůstat, bohužel i slávychtivost, a budou se zvyšovat i rizika. Odpovědnost totiž těžce pokulhává za dovedností. ¹⁾