CRISPR: přesná střelba na genetické cíle

Zásahy genových inženýrů do dědičné informace zhusta připomínaly střelbu do tmy. Nikdy nevěděli, zda a kam se strefí. To se v posledních letech mění, především zásluhou techniky CRISPR-Cas, která využívá „nářadí“ vypůjčené od bakterií. Jaroslav Petr o ní psal v květnovém Vesmíru (CRISPR-Cas9 – průlom v přírodních vědách, článek dostupný jen pro předplatitele), ale novinky na tomto poli přibývají tak rychle, že nyní nabízíme on-line další rozšiřující text od téhož autora. Třetí článek (Bude zapotřebí „dětí tří rodičů“?) vyjde v červnovém Vesmíru.

Technika CRISPR-Cas pro cílené zásahy do dědičné informace, která měla premiéru v roce 2012, se rychle stala „šlágrem“ molekulárně genetických laboratoří. Pomocí krátkého řetězce „naváděcí“ ribonukleové kyseliny přesně vyhledá určené místo v dědičné informaci a „molekulárními nůžkami“ enzymu nukleázy Cas pak „střihne“ do dvojité šroubovice DNA. Lze tak nejen s vysokou účinností narušit zvolené místo v dědičné informaci, nebo naopak na určené místo v genomu vnést úsek cizí DNA, ale také „brzdit“ nebo „akcelerovat“ jednotlivé geny. CRISPR-Cas se tak nabízí k využití pro mnoho praktickým účelů.

Genová terapie

Donedávna se „oprava“ poškozeného genu v buňkách člověka trpícího dědičnou chorobou podobala absurdní situaci, kdy přijede řidič do servisu, aby mu u auta opravili rozbitý světlomet. Automechanik ponechá poškozené světlo na místě a jako náhradu za něj namontuje na střechu zcela nový reflektor.

Vědci neuměli „havarovaný“ gen v dědičné informaci buněk nahradit genem neporušeným. Poškozený gen ponechávali na místě a k němu pak přidávali do genomu funkční gen. Nad místem, kam se nový gen „vmáčkne“, neměli kontrolu. Mohlo dojít i k tomu, že se léčebný gen zabudoval na místo, kde funkce dědičné informace vážně narušil.

Například v roce 2000 oznámil tým francouzských lékařů úspěšné vyléčení dvanácti chlapců trpících těžkou dědičnou nedostatečností imunitního systému pomocí přenosu nepoškozeného genu. Chlapcům se imunita obnovila. U tří ale po několika letech propukla leukémie a jeden na toto onemocnění zemřel. Na vině bylo zabudování léčebného genu na nevhodné místo dědičné informace malých pacientů.

CRISPR-Cas dovoluje výměnu defektního genu za fungující. O tom, že je to principiálně možné, se přesvědčili tým vedený Danielem Andersonem z Massachusetts Institute of Technology na myších s poškozeným genem FAH kódujícím enzym fumarylacetoacetát hydrolázu. ¹⁾ Lidé se stejným dědičným defektem trpí onemocněním zvaným tyrosinemie typu I. Poškozený gen nezajistí produkci fumarylacetoacet hydrolázy, která má za úkol rozklad toxického fumarylacetoacetátu na fumarát. V těle nemocného se hromadí toxiny a poškozují játra, ledviny a další orgány. Tyrosinémie typu I postihuje asi 1 ze 100 000 lidí. Dříve byli nemocní odkázáni jen na dietu, z které jsou vyloučeny potraviny přispívající ke zvýšení tvorby toxických látek v těle. Nověji pomáhá pacientům s tyrosinémií typu I lék nitisinon, který blokuje enzymy podílející se na tvorbě toxinů.

Myším s mutací genu FAH vpravili vědci přes cévy do jater CRISPR-Cas zacílený na mutovaný gen. Zároveň s ním dodali do jater i „záplatu“ na poškozený gen v podobě úseku DNA dlouhého asi 200 písmen genetického kódu. Jaterní buňky vychytaly dodané molekuly z krve. CRISPR-Cas poškozený gen rozstřihl. Buňka začala tuto „díru“ opravovat a přitom vsunula místo poškozeného úseku podstrčenou genetickou záplatu. Podařilo se tak opravit mutovaný gen v 1 z 250 jaterních buněk. Tyto buňky se začaly množit a postupně nahrazovaly buňky s poškozeným genem FAH. Nakonec nesla opravený gen FAH jedna třetina jater, a to stačilo k obnovení normálních funkcí orgánu. I při normální dietě a bez nitisinonu netrpěla zvířata většími zdravotními problémy.

Od pokusů na myších je k léčbě pacientů samozřejmě ještě daleko. Experiment Andersonova týmu ale ukázal, že stojí za to se na tuto cestu vydat.

Rakovina a virové infekce

I když jakékoli narušení dědičné informace podvědomě chápeme jako nežádoucí fenomén, jsou situace, kdy může taková „díra v DNA“ přinést člověku uzdravení. To platí například o nádorových buňkách, které se o překot množí právě díky pozměněným genům. Pokud bychom zacílili CRISPR-Cas na takovou „nádorovou verzi“ genu, genů ve zdravých buňkách by si nevšímal a ničil by jen dědičnou informaci rakovinných buněk. Zásah do DNA by mohl být tak drastický, že by buňky nádoru hynuly.

Jako první úspěšně vyzkoušeli tuto možnost v boji s rakovinou australští vědci z melbournského Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research. V laboratorních podmínkách se jim dařilo hubit buňky Burkittova lymfomu tím, že v jejich dědičné informaci speciálně konstruovaným CRISPR-Cas poškozovali gen MCL-1. ²⁾ Tento gen potřebují buňky lymfomu k přežití. Jen v Austrálii pracuje na podobných terapiích pro jiné typy nádorů asi padesátka vědeckých týmů.

Tým amerických vědců pod vedením Juana Carlose Izpisua Belmonteho z kalifornského Salk Institute zamířil CRISPR-Cas na dědičnou informaci viru HIV uloženou v DNA buněk nakažených lidí. ³⁾ Stávající léky dokážou sice bránit množení viru v organismu, ale nedokážou virus definitivně vymýtit. Virus přepíše svou dědičnou informaci ve formě kyseliny ribonukleové (RNA) do dvojité šroubovice DNA a tu pak vnese do DNA lidské buňky. Tento „genetický návod“ pro produkci nových virových částic ponechávají léky bez povšimnutí. Virová dědičná informace může v lidských buňkách „dřímat“ dlouhé roky. I když se zdá, že léky virus z těla nakaženého člověka vyhnaly, „spící“ virová dědičná informace se může kdykoli „probudit“ a organismus je znovu zaplaven viry. Proto musí pacienti užívat léky proti viru HIV po zbytek života.

Izpisua Belmonte a jeho spolupracovníci odzkoušeli CRISPR-Cas zacílený na úseky DNA virového původu v buňkách tvořících páteř imunitního systému. Podařilo se jim „vystřihnout“ životně důležité geny viru HIV z dědičné informace lidských buněk a virus tak zneškodnit. Informace viru HIV zmizela z více než 70 % všech ošetřených buněk. CRISPR-Cas si nevybíral. Ničil jak volnou dědičnou informaci viru, která se ještě nestačila zabudovat do dědičné informace buňky, tak i tu, která už se „vmáčkla“ do lidské DNA. Působil i preventivně. Pokud byl „na místě“ dříve než virus HIV, nedovolil mu, aby svou dědičnou informaci do lidských buněk vůbec propašoval. To považuje Izpisua Belmonte za největší úspěch.

„Za hlavní výhodu této technologie považuji fakt, že můžeme organismus předem chránit. Zneškodněním viru v raných fázích jeho životního cyklu můžeme předejít infekci lidských buněk virem podobně, jako je tomu při použití konvenčních vakcín,“ říká Izpisua Belmonte.

Virus HIV je znám svou proměnlivostí, a to samozřejmě zvyšuje riziko, že získá vůči CRISPR-Cas odolnost. Vědci proto zkoušejí nasadit na infikované buňky směs „naváděcích“ RNA, aby CRISPR-Cas napadal virus na více místech najednou. Tím by mělo riziko vzniku rezistentních kmenů viru HIV výrazně klesnout.

„Krisprová antibiotika“

Pomocí krátkého úseku „naváděcí“ RNA lze „molekulární nůžky“ nukleázy Cas zacílit na dědičnou informaci vybraných bakterií. To předurčuje CRISPR-Cas pro použití jako úzce cíleného antibiotika, které zničí pouze bakterie vyvolávající onemocnění a ponechá bez újmy ostatní bakterie, jež lidskému organismu dobře slouží (například druhově pestrou střevní mikrobiotu). Tato antibiotika by účinkovala i na původce chorob, kteří se stali k tradičním antibiotikům odolní.

První „krisprová antibiotika“ se objevila v roce 2014, když tým vedený Robertem Citorikem z Massachusettské techniky vytvořil CRISPR-Cas systém cílený na sekvence genu blaSHV-18 a genu blaNDM-1. Oba tyto geny kódují u bakterií rezistenci k širokému spektru beta-laktamových antibiotik, k nimž patří například penicilin. DNA pro tvorbu těchto CRISPR-Cas byly vneseny do bakteriofágových částic, kterým pak vědci vystavili směsnou populaci bakterií Escherichia coli. V ní nesly některé bakterie geny pro rezistenci blaSHV-18 nebo blaNDM-1, zatímco jiné tyto geny postrádaly. V laboratorních kulturách likvidoval CRISPR-Cas vnášený bakteriofágem velmi účinně bakterie nesoucí geny pro rezistenci. Bakterie, kterým cílové sekvence chyběly, nebyly infekcí bakteriofágem nijak postiženy. Rozdíl v přežívání obou populací Escherichia coli – tedy rezistentních a nerezistentních kmenů – byl desetitisícinásobný. ⁴⁾

Tým vedený Davidem Bikardem z Rockefeller University v New Yorku vytvořil CRISPR-Cas cílený proti sekvencím typickým pro methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA). Také v tomto případě dokázalo „krisprové antibiotikum“ výrazně snížit podíl MRSA ve směsné populaci kmenů Stahylococcus aureus, a to z 50 % na 0,4 %. ⁵⁾

Obě antibiotika založená na specifickém efektu CRISPR-Cas se osvědčila i při léčbě nakažených laboratorních živočichů. Citorikův tým zachránil „krisprovým antibiotikem“ zavíječe voskové infikované smrtícím kmenem Escherichia coli. Bikard se svými spolupracovníky vyléčil laboratorním myším kožní infekci vyvolanou bakterií Staphylococcus aureus rezistentní k methicilinu.

Nedořešen je zatím způsob, jakým by se „krisprová antibiotika“ podávala pacientům. Samostatný problém představuje možnost vzniku rezistence na tento typ antibiotik. V obou uvedených studiích nebyly všechny cílové mikroorganismy zahubeny dostatečně rychle a některé mohly podání „krisprového antibiotika“ přežít. Bikard se svým týmem analyzoval methicilin-rezistentní bakterie Staphylococcus aureus, které CRISPR-Cas odolaly, a odhalil nejméně tři různé příčiny selhání léčby. Do některých bakterií se CRISPR-Cas z bakteriofágu vůbec nedostal. Do jiných bakterií sice pronikl, ale bakterie ho zase rychle vyloučily. A byly zjištěny i případy, kdy sice CRISPR-Cas do bakterie pronikl, ale poškodil se a ztratil účinnost.

Není jasné, zda některé bakterie odolaly CRISPR-Cas nesenému bakteriofágem proto, že v důsledku mutace bakteriální DNA došlo k úplné ztrátě nebo k zásadní změně receptoru, přes který se bakteriofág zachytí na povrchu bakterie. Pokud se bakteriofág na bakterii neuchytí, nedodá CRISPR-Cas do její buňky a bakterie přežívá. Robert Citorik považuje vznik takové rezistence za reálnou hrozbu.

Jaká je tedy budoucnost „krisprových antibiotik“? „Antibiotika na bázi CRISPR-Cas budou muset prokázat účinnost přinejmenším stejně dobrou jako standardní antibiotika, v ideálním případě bez negativních dopadů na mikrobiom. To je skutečně vzrušující úkol. Zatím jsme ale na samém začátku jeho plnění,“ konstatuje v komentáři pro časopis Nature Biotechnology americká farmaceutická analytička Lynn L. Silverová.

Mutagenní řetězová reakce

Cílené poškození genu pomocí CRISPR-Cas technologie se nabízí jako elegantní cesta k tvorbě modelových organismů. Pokud má organismus vyřazen ze hry vybraný gen, dostává se obvykle do potíží. Z povahy těchto trablů mohou vědci vyčíst, jaké funkce gen za normálních okolností plní. K tomu je ale zapotřebí, aby byla zneškodněna jak kopie genů, které organismus získal od matky, tak i kopie genu, kterou zdědil po otci. To chce čas a trpělivost. Experimenty vyžadují tvorbu několika generací zkoumaného organismu. Valentino Gantz a Ethan Bier z University of California v San Diegu nyní objevili elegantní zkratku, která je dovedla k octomilkám s narušenou dvojicí genů během jedné jediné reakce. Takto navozený defekt se dokonce šíří populací a vysloužil si proto označení mutagenní řetězová reakce (mutagenic chain reaction čili MCR). ⁶⁾

Obvykle jsou instrukce pro tvorbu příslušného komplexu „vyhledávácí“ RNA s „molekulárními nůžkami“ nukleázy Cas vnášeny do organismu tak, aby se nástroj vytvořil na krátkou dobu, odvedl svou práci a pak zase zmizel. Často se vnáší instrukce pro tvorbu „vyhledávací“ RNA do jedné linie organismů a návod pro tvorbu nukleázy do jiné linie organismů. Komplex potřebný pro vyhledání vybraného místa dědičné informace a jeho rozstřižení vzniká v buňkách potomků, kteří zdědí každou z komponent komplexu od jednoho z rodičů. Gantz a Bier vnesli do dědičné informace embrya octomilky instrukci pro výrobu vodící RNA a nukleázy Cas v jediném „balení“ a upravenou tak, aby se genetický nástroj pro rozstřižení DNA ve vybraném místě vyráběl v každé buňce organismu octomilky, viz schéma:

Tento „balíček“ vnesli do embrya octomilky. Podle instrukce obsažené v „balíčku“ se vytvořily jak „naváděcí“ RNA, tak „molekulární nůžky“ nukleázy Cas a společně rozstřihly cílový gen. Embryo začalo poškozené místo opravovat a přitom do „mezery“ v rozstřižené DNA zabudovalo geny „balíčku“ pro tvorbu naváděcí RNA a nukleázy Cas. Tím byl jeden gen vyřazen z činnosti. Záhy se „balíček“ uložený v DNA embrya probudil k činnosti, vytvořil nástroj pro „stříhání“ DNA, a ten zlikvidoval i druhou kopii cílového genu. Už tato octomilka měla tedy vyřazené oba dva geny. Jejich absence se v pokusu Gantze a Biera projevila změnou barvy těla mušky.

Zajímavé výsledky přinesl pokus, kdy se octomilky s poškozenými geny křížily s normálními octomilkami, jež mají oba geny funkční, viz schéma:

Podle zákonitostí dědičnosti odhalených Gregorem Johannem Mendelem by měli potomci zdědit od jednoho rodiče poškozený gen a od druhého gen plně funkční. Více než 95 % mušek vzešlých z takového křížení má ale vyblokované oba geny, protože CRISPR-Cas zděděný od jednoho z rodičů okamžitě rozstřihl „zdravý“ gen zděděný od druhého rodiče a do mezery vsunul geny „balíčku“ pro tvorbu „naváděcí“ RNA a „molekulárních nůžek“ nukleázy Cas. Gantz a Bier nacházeli mezi potomstvem prakticky jen jedince s pozměněnou barvou.

„Úplně nás to omráčilo. Bylo to, jako kdyby slunce vyšlo na západě a ne na východě,“ popisuje překvapení nad účinností metody Ethan Bier.

Možnosti využití MCR sahají daleko za tvorbu laboratorních modelových organismů. Mutagenní řetězová reakce by mohla s vysokou účinností šířit změnu v dědičné informaci populacemi hmyzu přenášejícího nebezpečná onemocnění, jako jsou malárie, horečka dengue nebo chikungunya. Dnes jsou známé změny v dědičné informaci komárů, které brání množení původců malárie v těle hmyzího hostitele. Takoví komáři by pak nepřenášeli nemoc na lidi. Pokud by danou změnu dědičné informace nesl jen jeden ze sta komárů, pak by se vloha rozšířila na bezmála všechny komáry během pouhých deseti generací. To znamená, že by daná populace komárů ztratila schopnost přenášet malárii během jediné sezóny.

Gantz a Bier jsou si vědomi i rizik, které jsou s takovým volným šířením uměle navozených dědičných změn spojeny. Pokud by například z laboratoře unikli komáři nesoucí uměle vyvolanou změnu dědičné informace, mohla by se tato změna šířit mutagenní řetězovou reakcí naprosto nekontrolovaně mezi komáry ve volné přírodě. Následky je obtížné odhadnout. Kalifornští vědci prováděli své pokusy v laboratoři, která je proti úniku octomilek do okolí dokonale zajištěná.

„Chceme, aby vědci velmi důkladně zvážili tato rizika dříve, než se pustí do experimentování v laboratořích, které nejsou proti úniku organismů do okolí pořádně zabezpečené,“ vyzývá Ethan Bier a dodává, že vyloučit nelze ani úmyslné zneužití MCR. Proto vyzývá k uspořádání konference, na které by si odborníci jasně stanovili pravidla pro práci s organismy, jejichž dědičná informace by byla upravena metodou MRC. „Bylo by to něco podobného, jako byla konference v Asilomaru v sedmdesátých letech minulého století, kde se vědci zabývali bezpečností experimentů na poli tehdy se rodícího genového inženýrství,“ říká Bier.

Valentino Gantz je přesvědčen, že je zapotřebí vyvinout i techniky, s jejichž pomocí by bylo možné dostat volně se šířící genetickou změnu opět pod kontrolu. Omezení výzkumu na tomto poli by ale asi nebylo to nejlepší řešení. Technika MCR by mohla najít využití nejen při prevenci chorob přenášených hmyzem. Podobně jako se genetická změna šíří populací octomilek, mohla by se šířit i mezi buňkami v rámci jednoho organismu. To by pomohlo při léčbě nádorových onemocnění nebo při zdolávání virových infekcí. Lékaři by mohli použít CRISPR-Cas, který rozeznává úseky dědičné informace typické pro nádorové buňky a vyřadí z činnosti geny, jež jsou nezbytné pro růst nádoru. „Řetězovou reakcí“ by se tento zásah šířil na všechny vnímavé rakovinné buňky. Podobně by mohl CRISPR-Cas rozeznávat buňky, do kterých zabudoval svou dědičnou informaci virus HIV. Postupně by se tak mohly buňky infikovaného člověka od virové dědičné informace HIV zase očistit.

CRISPR jako kontrolor genů

Technologie CRISPR-Cas už zdaleka neslouží jen k narušení vybraných genů nebo k vnášení cizí DNA na přesně vybrané místo dědičné informace. S její pomocí lze geny ovládat, to znamená potlačovat či naopak posilovat přepis genu do jednovláknového řetězce RNA, jenž slouží jako instrukce pro syntézu molekuly proteinu.

Tým vedený Wendellem Limem z University of California v San Francisku napojil vyhledávací řetězec RNA na molekulu nukleázy Cas, která je pozměněna tak, že už nedokáže štípat řetězec DNA. Na tyto „otupené molekulární nůžky“ jsou navěšeny další bílkovinné molekuly, které regulují přepis DNA na jednovláknovou RNA. ⁷⁾ Vědci použili bílkovinu VP64, která tomuto přepisu brání, a bílkovinu KRAB, která naopak přepis genu do molekuly RNA posiluje a pohání do vyšších obrátek. Získali tak skvělý nástroj pro cílené zásahy do procesů v buňce. Vyhledávací řetězec je zkonstruován tak, aby doručil nefunkční „nůžky“ s příslušným „přívěskem“ na místo, kde pak „navěšená“ bílkovina odvede svou práci – tedy potlačí či naopak popožene tvorbu nových „instrukčních“ řetězců RNA, a ovlivní tak produkci proteinu.

Tento způsob ovládání genů vyzkoušeli Lim a spol. na kvasinkách i na lidských buňkách kultivovaných v laboratorních podmínkách. Zdaleka ne všechny kombinace vyhledávací RNA a navěšených proteinů fungovaly tak, jak si vědci naplánovali. A když už se dařilo „brzdit“ nebo naopak „akcelerovat“ geny, ukázalo se, že jeden a tentýž molekulární „ovladač“ sešlapává pomyslný brzdový či plynový pedál genové aktivity jinou měrou u kvasinek a jinou u lidské buňky. V řadě případů však byli vědci s výsledkem spokojeni.

Obrovskou výhodou tohoto přístupu je, že lze do buněk vypustit najednou hned několik různých „ovladačů“. Vědci tak mohou působit na několik genů současně, přičemž některé lze aktivovat a u jiných naopak aktivitu potlačit. U kvasinek dokázali vědci najednou kontrolovat funkci tří genů ovládajících komplikované metabolické děje a díky tomu mohli navodit v jejich buňkách pět odlišných stavů.

Aktivita genů není zdaleka regulována jen tím, že příslušné bílkoviny usnadní nebo naopak zkomplikují přepis DNA do řetězce „instrukční“ RNA. Významnou roli hraje i to, jak je daný úsek dvojité šroubovice DNA „namotán“ na „cívkách“ tvořených bílkovinnými histony. Způsob „namotání“ se odvíjí od typu „úprav“ histonové „cívky“. Modifikace histonů je součástí tzv. epigenetických procesů, které neovlivňují samotnou dvojitou šroubovici DNA, ale probíhají na jejím povrchu či v těsném sousedství. CRISPR-Cas systém nyní dovoluje zasáhnout do aktivity genů i na této úrovni regulace.

Vědci pod vedením Charlese Gersbacha z Duke University zkonstruovali ovladač genů z vyhledávacího krátkého řetězce RNA napojeného na nefunkční „molekulární nůžky“ nukleázy Cas, na něž je přivěšen enzym připojující k histonům acetylovou skupinu. ⁸⁾ Po napojení acetylu na histony se mění způsob namotání DNA na pozměněné histonové „cívky“, a tím se mění i aktivita genů. Gersbach a spol. tímto způsobem změnili „namotání“ DNA v místech tzv. promotorů a enhancerů. Tato místa DNA sama o sobě nekódují produkci žádné bílkoviny, ale jsou důležitá pro řízení aktivity genů ležících často v těsném sousedství nebo i na poměrně vzdálených místech dědičné informace. Gerbachovi a spol. se tak podařilo aktivovat vybrané geny.

Role promotorů a enhancerů není zatím prozkoumána. Miliony různých úseků DNA jsou v podezření, že by mohly sloužit jako enhancery, ale vědci zatím neměli vhodný nástroj k tomu, aby taková podezření potvrdili nebo vyvrátili. Přitom poškození enhanceru může mít pro člověka vážné následky. Některé typy zhoubných nádorů, neurodegenerativních onemocnění či kardiovaskulárních chorob můžou být vyvolány právě poškozením enhanceru a následnou změnou aktivity většího počtu genů.