Epitachoforéza

Analytická chemie je obor zabývající se rozborem vzorků ze všech představitelných oborů lidské činnosti. Analýzou chceme zjistit, co a v jakém množství vzorek obsahuje. Každou analýzu můžeme rozdělit na několik po sobě jdoucích kroků. Začínáme odběrem vzorku, následuje jeho uskladnění a přeprava do laboratoře, příprava k analýze (koncentrace, čištění) a samotná analýza. V současné době je velký důraz kladen na zvyšování účinnosti analytických detekčních technik. V ideálním případě bychom chtěli detekovat jednotlivé molekuly. Přesto, anebo právě proto, jsou kroky předcházející stanovení látek kritickou a často opomíjenou částí analýzy. Jejich provedení má však přímý a významný vliv na přesnost a správnost získaných výsledků. Zároveň jsou největším zdrojem chyb. Zejména biologické vzorky se snadno znehodnotí.

Analýza DNA je stále rozšířenější, levnější a nachází široké uplatnění v praxi. Moderní metody analýzy nukleových kyselin (polymerázová řetězová reakce a Next Generation Sequencing) potřebují jako vstupní materiál dostatečně čistou DNA bez příměsí, které by mohly ovlivňovat výsledky analýzy. Běžný klinicky odebíraný vzorek, jako jsou sliny, krev, plazma, moč nebo vzorky tkání, je však velmi složitou směsí látek. V praxi to znamená získat DNA ze směsi bílkovin, solí, cukrů, zbytků buněk a dalších sloučenin. Extrakční metody, které jsou v současné době používané, poskytují dostatečně kvalitní DNA. Mají však také významné nevýhody. První nevýhodou těchto metod je, že vyžadují opakované, časově náročné a obtížně automatizovatelné postupy (promývání, srážení a odstřeďování). Druhou a velmi závažnou nevýhodou jsou významné ztráty DNA, která je ve vzorku přítomna pouze ve velmi malém množství. Často je nutné používat různé podmínky pro každou velikost řetězce DNA. Další nevýhodou je nutnost pracovat pouze s malým objemem vzorku, typicky do 1 mililitru, přestože je běžně odebíráno mnohem větší množství, např. 4 mililitry krve či desítky mililitrů moči. Tyto nevýhody nabývají na významu u aplikací, u nichž máme velký objem vzorku, který obsahuje jen několik kopií DNA. Mezi tyto aplikace patří analýza volně cirkulující DNA plodu v krvi matky (používá se pro neinvazivní prenatální diagnostiku a nahrazuje odběr plodové vody) nebo analýza DNA nádoru z krve pacienta (slouží ke klasifikaci nádoru před navržením účinné terapie). Běžně se v těchto případech používá biopsie – odběr části nádoru. Další aplikace, kde jsou k dispozici pouze velmi malá množství výchozí DNA, je sledování mikrobiálních infekcí pomocí sekvenace jejich DNA získané z krve, výtěrů, moči nebo stolice.

Schéma vyvinutého zařízení.

Z výše uvedených důvodů byla v našem ústavu vyvinuta ve spolupráci s divizí Roche Sequencing Solutions v kalifornském Pleasantonu nová metoda extrakce a koncentrace DNA, kterou jsme pojmenovali epitachoforéza. Tato elektromigrační metoda využívá koncentrace DNA při pohybu v elektrickém poli mezi vedoucím a koncovým elektrolytem. Vhodnou volbou vedoucího a koncového elektrolytu lze provést oddělení DNA od ostatních složek vzorku. Iony s opačným nábojem budou migrovat k opačně nabité elektrodě, neutrální látky nebudou migrovat vůbec a iony se stejným nábojem, ale jinou elektroforetickou mobilitou zůstanou ve vedoucím nebo koncovém elektrolytu. Zařízení vyvinuté na ÚACH má kruhový tvar a umožňuje teoreticky bezztrátovou koncentraci a separaci DNA z velkého množství vzorku, které je omezeno pouze velikostí zařízení a časem izolace. Zařízení se skládá z kruhové nádoby, do které je umístěno stabilizační médium s vedoucím elektrolytem. V jejím středu je otvor, v němž je umístěna nádobka se dnem z polopropustné membrány na sběr koncentrované DNA. Přes tuto membránu mohou procházet malé iony, ale ne velké molekuly, jako je DNA. Sběrná nádobka je spojena se zásobníkem vedoucího elektrolytu s Pt elektrodou (anodou). Na okraji kruhové nádoby je upevněna kruhová drátěná elektroda (katoda). Mezi katodu a stabilizační médium s vedoucím elektrolytem se nalévá koncový elektrolyt smíchaný se vzorkem. Po vložení elektrického napětí migrují aniony DNA směrem ke středu zařízení, kde jsou následně odebrány ze sběrné nádobky pro další analýzu.

Vzhledem k tomu, že rychlost migrace DNA v elektrickém poli prakticky nezávisí na délce řetězce, dochází při tomto způsobu izolace k získání všech velikostí řetězců DNA. Epitachoforéza je tedy univerzálně použitelná jak pro krátkou, tak i velmi dlouhou DNA. Je však také možné použít na místě stabilizačního média separační gel a koncentrovat jen fragmenty DNA požadované délky. Stupeň zkoncentrování DNA proti původnímu vzorku je dán především fyzickým omezením zařízení. Velikost zařízení určuje objem vzorku a velikost sběrné nádobky zase objem získaného roztoku.

Využití vyvinuté metody a zařízení není omezeno pouze na čištění a koncentraci DNA, ale může být použito pro všechny látky ionové povahy. Patří sem široké spektrum analytů od malých organických nebo anorganických ionů přes nejrůznější metabolity, peptidy, velké biomolekuly jako DNA, bílkoviny a nabité oligosacharidy až po částice a viry nebo bakterie. V současné době probíhá vývoj komerčního zařízení, které by se mělo dostat v blízké době na světový trh.

Záznam epitachoforetické koncentrace fluorescenčně značené DNA.