Aktuální číslo:

Transgenní technologie a laboratorní myši

Nepostradatelné nástroje výzkumu lidských chorob Ústavu molekulární genetiky AV ČR, v. v. i., je padesát let Vesmír 91, 654, 2012/11

Vladimír Kořínek, Radislav Sedláček

| 6. 12. 2012

| Vesmír 91, 720, 2012/12

Chceme-li porozumět specifickým funkcím jednotlivých genů a jejich významu pro tělesné funkce, je potřeba studovat jejich roli nejen v kontextu jednotlivých buněk, ale i ve vysoce komplexním prostředí celého organismu. Neustálé zdokonalování technologií umožňujících manipulovat s geny „ve zkumavce“ a měnit genetickou výbavou organismu, stejně jako kompletní znalost genetické informace („genomu“) vytvořily z laboratorní myši zřejmě nejlepší zvířecí „model“ široce využívaný pro biomedicínský výzkum. Ve srovnání s nesavčími živočichy je největší předností tohoto malého hlodavce vysoká podobnost s lidským organismem včetně mnoha fyziologických a patologických pochodů, vývoje embrya a do jisté míry i mechanismů ovlivňujících chování. V letech 2008–2009 věnoval Ústav molekulární genetiky velké úsilí i nemalé finanční prostředky do moderního vybavení nezbytného pro etablování transgenních technologií. Nové, v České republice unikátní centrum, „vyrábí“ transgenní myši využitelné pro studium fungování jednotlivých genů v různých tkáních a orgánech těla savců.

Myš jako modelový organismus

Rozklíčování sekvencí lidského, myšího a dalších genomů na přelomu tisíciletí poskytlo nové informace funkční, srovnávací a evoluční genomice a vytvořilo základ novodobé strategie výzkumu funkce genů i nekódujících oblastí genomu. V současnosti, v tzv. postgenomickém období, kdy známe sekvence všech lidských i myších genů a jejich genomovou organizaci, se zvyšuje efektivnost v poznání funkce každého jednotlivého genu a v tomto úsilí dominují myší mutantní modely.

Myší model poskytuje řadu unikátních rysů, jako je definované genetické pozadí, sofistikované nástroje pro manipulaci genů i krátká reprodukční doba. Při využití myši jako modelu pro výzkum lidských genů a jejich fyziologických a patologických funkcí je však nejdůležitější značná genetická podobnost obou organismů. Myš a člověk sdílejí víc než 99 % genů. Snahou mnoha prestižních vědeckých institucí je během nadcházejícího desetiletí vytvořit myší modely, u nichž by každý jednotlivý gen mohl být podmínečně funkčně vyřazen. Tak bychom získali informace o jeho funkci a dostali souhrnný obraz o působení genů v organismu. V první fázi se připravují mutace každého genu na úrovni embryonálních kmenových buněk, ve fázi druhé se vytváří vlastní myší modely, které jsou následně charakterizovány (tzv. fenotypizace).

Knock-out, knock-in a vývoj technologie genových modifikací

Základy transgenních technologií položili M. Evans, O. Smithies a M. Capecchi, kteří byli r. 2007 oceněni Nobelovou cenou. Od prvních publikací na počátku osmdesátých let minulého století se technologie manipulace genomu výrazně zlepšila a v současnosti umožňuje tvorbu transgenních podmíněných mutantů. S jejich pomocí lze zkoumat funkci genů v předem definovaných tkáních, přičemž je možné mutaci, a tím i poruchu sledovaného genu, vyvolat kdykoli během života zvířete. Podmíněné modely jsou důležité také u genů, jejichž ztráta by byla letální, neboť jsou nepostradatelné pro embryonální vývoj.

Transgenní technologie vyústily do dvou hlavních technologických přístupů. Nejdříve to byla rychlá a ekonomická konvenční pronukleární injekce (injekce do prvojádra oplodněného vajíčka). Její renesanci zažíváme nyní v podobě nástrojů zvaných nukleázy „zinc-finger“ a TALE (transcription activator-like effector). Tyto enzymy dovedou v genomu rozeznat specifickou cílovou sekvenci a přerušit ji. Modifikovaný gen tím ztrácí svou funkci.

Druhý přístup je technologicky náročnější a využívá principu homologní rekombinace a manipulace s embryonálními buňkami myší. Poskytuje nepřekonanou přesnost v přípravě genových modifikací s využitím principu podmíněnosti. To znamená, že gen neztratí svou funkci ve všech tkáních nebo lze ztrátu jeho funkce načasovat do dospělosti. Transgenní mutanti připravení touto technologií se označují ve vědeckém žargonu jako knock-out (ztráta funkce genu) či knock-in (získání nové funkce genu).

Transgenní technologie v ÚMG

Transgenní technologie, přestože se jich v biomedicínském výzkumu hojně využívá, nejsou triviální záležitost. Vyžadují specializované know-how, zasvěcený personál, chovné kapacity a nezbytné technické vybavení. Do roku 2008 byly v ČR snahy vytvářet transgenní myší modely neúspěšné. Pokud vědci chtěli výzkum genů in vivo provádět, museli buď odejít do zahraničí, nebo si nechat „své“ mutanty v zahraničí vytvořit. Právě r. 2008 ÚMG investoval nemalé prostředky a úsilí do vybudování specializované laboratoře, která zavedla všechny dosud známé transgenní technologie a některé nové vyvíjí. ÚMG je tak jediným centrem v ČR, které připravuje pro českou i mezinárodní vědeckou komunitu nejrůznorodější myší transgeny pro biomedicínský výzkum. Tyto geneticky pozměněné myši se využívají k určení fyziologické role genu nebo jejich funkce při rozvoji chorob. Od svého založení vytvořila transgenní laboratoř ÚMG desítky myších mutantních kmenů. Zahrnují klasická transgenní zvířata vzniklá injekcí do prvojádra, ale také např. velké genomové konstrukty umělých bakteriálních chromozomů (tzv. BACs), nebo i nové kmeny z geneticky pozměněných embryonálních kmenových buněk obsahujících zmíněné podmíněné mutace.

Další know-how poskytované vědecké komunitě představuje možnost uchování zamražených myších kmenů (tzv. kryoarchivace) a jejich zpětná reanimace či rederivace. Pokud chce český vědec získat mutantní myši ze zahraničí a převoz živých zvířat je komplikovaný, zakoupí embryonální buňky nebo spermie a pomocí zavedených metod z nich žádané jedince vytvoří. Obdobným způsobem je možné zárodečné buňky nebo embrya určitého kmene zamrazit a v případě potřeby znovu „oživit“ (reanimovat).

Transgenní postupy skýtají i možnost ozdravení chovu. V případě, že jsou zvířata nakažena např. nežádoucím virem, který by mohl zkreslit výsledky výzkumu, transgenní laboratoř dovede přenést neinfikovaná embrya v raném vývojovém stadiu do náhradních matek chovaných v téměř sterilních podmínkách. Tam se z takto přenesených embryí narodí a vyrostou ozdravení (rederivovaní) jedinci. Celý komplex transgenních a genově manipulačních technologií tak vytváří nové možnosti nejen při výzkumu funkce genů, ale i při usnadnění chovu pokusných zvířat.

Blízká budoucnost: znalost funkce každého genu.

V současné době, kdy jsou sekvence lidských, myších i dalších genomů dostupné, se zvyšuje úsilí poznat funkce každého jednotlivého savčího (tedy i lidského) genu. Při tom hrají významnou úlohu již zmíněné myší mutantní modely s podmíněně „vypínatelnými“ geny. Během další dekády vzniknou tisíce myších mutantů, u nichž bude určitý gen podmíněně vyřaditelný. Podrobná charakterizace (tzv. fenotypizace) těchto myších modelů poskytne souhrnný obraz o genetickém základu fungování organismu. Jelikož naprostá většina myších genů odpovídá genům lidským, práce na myších mutantech přinese základní poznatky i pro lidskou molekulární genetiku. Lze očekávat, že výsledky této vědecké práce budou mnohem důležitější než samotná znalost vlastní sekvence genů. Proto již vzniklo několik mezinárodních konsorcií jako např. evropské INFRAFRONTIER a celosvětové IMPC (International Mouse Phenotyping Consortium), která sdružují přední světové instituce pracující na vytvoření Encyklopedie funkcí savčích genů. Ústav molekulární genetiky AV ČR, v. v. i., se díky projektu BIOCEV stává součástí těchto konsorcií a na těchto prestižních projektech se již podílí.