Optické mikroskopy s velmi vysokým rozlišením

Člověk si od nepaměti vytvářel v mysli obraz světa na základě informací, jež mu přinášely smysly. Z nich zrak dosáhl nejdále a podával nejpodrobnější zprávy. Avšak první revoluce v historii smyslového poznávání před čtyřmi sty lety ukázala možnost dosah zraku nesmírně vystupňovat – zrodily se dalekohled a mikroskop. Teprve před šedesáti lety se k těmto přístrojům, vytvářejícím obraz v původním smyslu slova, přiřadily i přístroje další, vytvářející také dvourozměrné pole informací, avšak o jiných než optických vlastnostech objektů. Byly to mikroskop elektronový, protonový, ultrazvukový, rentgenový, síly atomové, dielektrický aj. Ukázalo se brzy, že i tato pole jsme schopni rozumem zpracovat nejlépe a nejrychleji, když se přemění v obrazy optické a tak se předloží ke zpracování našemu mozku přímo, skrze jeho součást, sítnici oční. Z těchto přístrojů je dnes nejdůležitější elektronový mikroskop. Ten však, ač má lepší rozlišení než mikroskop optický, jej v biologii nikdy plně nenahradí, protože není schopen zobrazovat předměty zaživa. Proto optický mikroskop zůstane nástrojem všech, kteří chtějí „vidět“, co se v živých organizmech děje.

Vynálezce mikroskopu neznáme. Bylo jich asi více a mikroskop dlouho zůstával jen zajímavou hračkou. Vědeckým přístrojem se stal až v rukách A. Leeuwenhoeka a M. Malpighiho před třemi sty lety. Dobrých teorií se dočkal před sto lety od E. Abbea pro objekty osvětlené a od J. W. Rayleigha pro objekty svítící. Byl stále zvolna zdokonalován, až před padesáti lety F. Zernike svým fázovým kontrastem podstatně zlepšil výraznost struktur živých objektů. Ale zlepšit rozlišení se nedařilo a tvrdilo se, že to zapovídá teorie. Leč před čtyřiceti lety se začaly objevovat práce, které spojovaly v jedno různé aspekty rozlišení (v jedné, ve dvou, ve třech souřadnicích prostorových a v souřadnici časové) a dokazovaly teoreticky, že rozlišení zlepšit lze a že rozlišení v jedné souřadnici lze stupňovat bez teoretického omezení tak, že obětujeme rozlišení v druhých souřadnicích. To se ostatně dělalo intuitivně odjakživa: Souřadnice ve směru optické osy se omezovala rozmačkáváním, krájením, broušením. U interferenční mikroskopie se naopak rozlišení ve směru osy zlepšovalo na účet rozlišení příčného. Avšak právě tyto praktiky omezovaly mikroskopování objektů živých. Matematické teorie mikroskopu, z nichž se odvozovaly vzorce pro výpočet rozlišení, jsou založeny na teoretickém objektu, který nemá v praxi význam, jako je mřížka ze střídajících se propustných a nepropustných pruhů: nešlo totiž matematicky zvládnout objekty složitější.

Lord Rayleigh zvolil své „teoretické oko“ tak, aby bylo právě schopno zjistit sedlo mezi nejprostšími teoretickými obrazy dvou blízkých nekoherentně svítících bodů tak od sebe vzdálených, že nulté maximum obrazu jednoho padne do prvního minima obrazu druhého bodu (obrázek). Avšak jakmile jsme se přestali dívat pouze okem a začali fotografovat a používat obrazovou elektroniku, ztratilo toto kritérium mnoho ze svého významu: Tvrdší gradace ve fotografii či zvětšení kontrastu v televizi umožňují zlepšit rozlišení téměř libovolně: Meze tu kladou jen šum v elektronice, špína a aberace v optice, nedokonalosti zdrojů světla apod.

Tento ruch v teorii vedl k pokusům z hlediska praxe bezcenným (zkoušelo se totiž zlepšit rozlišení mikroskopů předtím uměle zkažených). Avšak to, že pokusy teorii potvrzovaly, vedlo ke snahám skutečně a zásadně mikroskop zdokonalit. Poprvé se to podařilo M. Minskému pomocí řádkování, ale jeho patentové přihlášky z r. 1957 a patentu z r. 1961 si mikroskopikové všimli až v letech osmdesátých.

Základem všech „řádkovacích mikroskopů druhého druhu“ (termín T. Wilsona) je, že netvoří obraz vcelku a najednou, nýbrž bod po bodu, řádkováním. Řádkování se sice zavedlo do mikroskopie už v letech padesátých, aby bylo možno obrazy přenášet na obrazovku nebo je fotometrovat, ale to se řádkovalo tak, že se v obyčejném mikroskopu osvětloval předmět jediným pohybujícím se světelným „bodem“, elektricky se měřilo všechno prošlé světlo a tímto signálem se moduloval jas obrazovky, jež se řádkovala synchronně s osvětlením. Tento „řádkovací mikroskop prvního druhu“ má v nejlepším případě jen stejné rozlišení jako mikroskop klasický.

Avšak Minsky a jiní po něm řádkování zdokonalili zásadně: Osvětlili předmět jediným „světelným bodem“ (ve skutečnosti rozptylovým obrazcem – kroužkem Airyho nebo jemu podobným, obr. 1) a v obrazové rovině vzali za obraz tohoto „bodu“ pouze centrální část (nulté maximum) tohoto kroužku. Jinak řečeno: Světlo, které se v klasickém mikroskopu do obrazu daného bodu dostává z jiných (nepříslušných) bodů předmětu, nebylo k tvorbě obrazu připuštěno (protože tyto nepříslušné body nebyly osvětleny) a světlu, které by se normálně dostalo jinam, než do geometricky určeného bodu obrazu, se v tom zabránilo též, a to nepropustnou clonou. Jestliže totiž neosvětlujeme předmět celý, nýbrž jen jeho nepatrnou plošku („bod“), víme předem, kde obraz tohoto bodu bude. Vše, co neznáme a musíme tedy určit pokusem, je jen jas příslušného bodu v obraze, popřípadě ještě barevné rozložení jasu. Touto clonou tedy vyloučíme světlo, jež by v obraze nevypovídalo o bodu, který měříme nyní, a zkreslovalo by měření jak v bodech, kde jsme už měření ukončili, tak v bodech, kde teprve měřit budeme. Nicméně, protože v předmětu jsme přecejen neosvětlovali pouze geometrický bod, ale slabě i nepatrné okolí tohoto bodu, nějaké „nepříslušné“ světlo se přece jen do obrazu dostalo. Totiž světlo, jež se odrazilo v okolí předmětového bodu (a též uvnitř mikroskopu) a zabloudilo do obrazového bodu, kde právě měříme. (To je světlo, jež se sem dostalo stejným způsobem, jakým se světlo osvětlující bod předmětový dostává do rozptylových kroužků kolem tohoto bodu.) Tohoto světla je však jen velmi málo.

Řádkovat je pak možno dvojím způsobem: Buď pohybujeme předmětem – velkou výhodou je tu podstatné snížení nároků na objektiv, stačí jej totiž korigovat pro osový bod. Také velikost obrazového pole není omezena a jeho okraj není tmavší (není vignetován). Velikou nevýhodou však je, že objekty, které nejsou tuhé, se musí posunovat velmi pomalu, aby se netřásly. Tak řádkoval M. Minsky a dvacet let po něm C. Sheppard, T. Wilson a mnozí jiní. Nebo je objekt v klidu a řádkuje se pohybem optických členů (zrcadel, objektivů) – tak to dělá např. V. Wilke u Zeisse v Oberkochenu.

Z dosti složité teorie i z našich praktických pokusů plyne, že stranové rozlišení takových mikroskopů je (posuzováno podle stejných kritérií) asi 1,4krát lepší než u klasického mikroskopu a rozlišení ve směru optické osy je nesrovnatelně lepší (nejméně desetkrát, často mnohem víckrát). Pokusy ukazují, že pozorovatelnost detailů u živých objektů se kvalitativně podobá obrazu ve fázovém kontrastu a v podobných zařízeních zvyšujících kontrast. Rozlišení měřené pomocí mřížek a rozsivek je skutečně asi jedenapůlkrát lepší než v obyčejném mikroskopu s týmž objektivem a lze je dále zlepšit úpravou pupily (jejím prstencovým tvarem), takže nakonec může být příčné rozlišení víc než dvakrát lepší než u klasického mikroskopu.

Velké potíže v práci působí „pomalost“ většiny těchto mikroskopů. Už jen nalézt to, co chceme pozorovat, bývá práce takřka sisyfovská: Vytvoření celého obrazu (prořádkování pole obvyklé velikosti) trvá kolem deseti sekund a tak hledání malého objektu v tlustém preparátu může trvat desítky minut.

Sami jsme se do této problematiky dostali při vyvíjení mikroskopu pro mikrofyziologii, určeného k pozorování živých buněk a tkání. Časová souřadnice byla pro nás tedy také důležitá. A práci jsme začínali r. 1964, tedy v poměrech, kdy použití počítačové obrazové techniky nepřicházelo ještě v úvahu. Šli jsme také jinou cestou než Marvin Minsky, jehož patent jsme ani neznali: Zvolili jsme řádkování ne jedním párem dírek (jedna dírka v osvětlení, jedna v zobrazení, jak popsáno výše), nýbrž párem množin dírek a rozhodli jsme se zkusit to s modifikací stařičkého a klasického zařízení – Nipkowova kotouče. Ten byl patentován r. 1884 a používal se k řádkování obrazu v začátcích televize. Nipkowův kotouč tehdy sloužil nejenom k převodu dvourozměrného spojitého obrazu v jednorozměrný časově spojitý signál, který je možné elektricky přenášet, nýbrž i k rekonstrukci obrazu z tohoto přeneseného signálu.

Pokud v následujícím přece jen poněkud technickém popisu ztratíte orientaci, klidně přeskočte text až k předposlednímu odstavci. V kotouči na vysílací straně byla řada dírek seřazených na jednom závitu Archimédovy spirály. Nad obrazem byla v každém okamžiku jediná dírka, určující jeden bod. Světlo procházející dírkou se měřilo a výsledek měření se přenášel do přijímače, kde řídil osvětlení v jednom bodě obrazu. Umístění tohoto bodu se určovalo podobným diskem s dírkami, který se otáčel synchronně s diskem vysílacím. Pro svůj účel jsme však ve vzoru kotouče udělali dvě důležité změny: Abychom vůbec mohli dosáhnout dostatečně jemného řádkování, tj. abychom teoretické větší rozlišení také skutečně využili k tvorbě obrazu ukazujícího víc detailů, než obraz v klasickém mikroskopu, musíme řádkovat ne jedním „bodem“, nýbrž mnoha „body“ zároveň (obrázek). Tak také zvýšíme rychlost řádkování (každý „bod“ řádkuje jen část celého obrazu) i jas obrazu (je v něm více elementů nesoucích světlo, tj. obraz je světelnější), takže jej bude možno pozorovat okem. Druhá modifikace je pouze praktická: Aby stačil jediný kotouč pro obě řádkování, zvolíme vzor rozložení dírek v kotouči středově souměrný. V každém okamžiku budeme mít k dispozici dvě stejná pole dírek (jen vůči sobě pootočená o 180^o), jedno pro osvětlení předmětového pole, druhé (okulárové) pro propouštění pouze toho světla, jež bylo odraženo osvětlenými body zaostřené obrazové roviny. Jinými slovy, tato dvě pole dírek, osvětlovací a obrazové, jsou spolu souměrná podle středu, kolem něhož se kotouč otáčí a tak neustále řádkuje jak osvětlení, tak obraz. Jinak: Pole v předmětu se polopropustným, poloodrazným zrcadlem zobrazí vlastně na pole dvě, předmětové a obrazové. Ta se dalšími třemi zrcadly posunou a pootočí, aby ležela na protilehlých, spolu podle středu souměrných polích dírek (umístěných na Archimédových spirálách) v rotujícím Nipkowově kotouči. To znamená, že se jak pro osvětlení předmětu, tak pro jeho zobrazení nepoužijí celá pole, nýbrž jen asi jedno procento plochy každého z nich, totiž pouze plocha dírek představujících okamžitý obraz pole předmětového a pole okulárové (obrazové). Aby polopropustné zrcadlo nezdvojovalo obraz (odrazem na své vrchní a zároveň i spodní ploše) a nevnášelo do něj svou tloušťkou astigmatizmus, je vyrobeno z tenoučkého (asi 5 m) napjatého listu slídy, pokrytého polopropustnou – poloodraznou vrstvou. (Další dvě zrcadla – vstupní a zrcadlo nad objektivem – jsou tu jen proto, aby zdroj světla, objektiv a osa Nipkowova kotouče mohly mít vhodnou orientaci.) Za půl otáčky kotouč prořádkuje celý obraz jedné předmětové roviny, takže lze pozorovat i rychlé pohyby, pokud ovšem objekt zůstává ve stejné vzdálenosti od objektivu.

Obrazy v našem mikroskopu překvapí zkušeného mikroskopika především tím, že jsou vždy ostré: Buď totiž předmět (nebo jeho část) je zaostřen, a pak je i jasně a ostře vidět, anebo není zaostřen, ale pak není ani osvětlen, ani zobrazen. Takže u neprůhledných objektů křivých tak zobrazíme jen průřez touto „hornatou krajinou“ v „jedné nadmořské výšce“ a vše, co neleží v rovině ostrosti, zůstane temné. Budeme-li během fotografování měnit zaostření, zobrazíme průmět této „hornaté krajiny“ do roviny, její mapu. A budeme-li při tom měnit také barvu osvětlení, dostaneme na mapě i barevné pásy vrstevnicové, jaké se používají na mapách povrchu zemského. Stejně i na fotografiích průsvitných biologických objektů můžeme různými barvami zobrazit detaily ležící v různé hloubce. Mají-li stupně jen malou výšku (jak je tomu například u integrovaných obvodů v elektronice, viz obrázek), dostaneme stejný výsledek i mnohem „laciněji“, pomocí běžných objektivů nevalně korigovaných chromaticky: obrazy různých „pater“ obvodu mají tu pak různou barvu, což může i usnadnit jejich interpretaci.

Zamyslíme-li se nad historií mikroskopie, nad stálou snahou zlepšit zásadně jak rozlišovací schopnost, tak množství informace a její rozměrnost, zdá se nám, že právě nadešla doba, kdy je takové zásadní zdokonalení v biologické mikroskopii poprvé ve větším rozsahu a do větší hloubky možné a že náš mikroskop s dvojitým řádkováním (Tandem Scanning Microscope) je pro tento účel jednou z nadějných možností. Aby se však stal všeobecně použitelným a všeobecně rozšířeným, zbývá vykonat spoustu drobné práce. Vzpomeňme jen, jak dlouho trvalo, než klasický mikroskop povýšil – aniž se při tom zásadněji změnil – z hračky v přístroj vědecký, a potom dokonce v lékařský diagnostický. K tomu je totiž třeba nejen umět s přístrojem dobře zacházet, nýbrž i nasbírat spoustu zkušeností k co nejdokonalejšímu vzájemnému přiřazení obrazu a chorobného stavu. Je třeba desítek let, než se nová metoda zabydlí v praxi. Jsme však tak domýšliví, že věříme, že mikroskopy pracující na našem principu se takovými všeobecně používanými přístroji stanou, i když už je do těchto oblastí sotva dovedeme my a i když dnes jen kvete obchod s přístroji našemu mikroskopu sice příbuznými, jež však povětšině pracují mnohem pomaleji a přitom jsou zhruba desetkrát dražší.