DNA Jeho imperátorského veličenstva

Kostrové pozostatky Mikuláša II., z milosti božej vládcu Ruska, cára moskovského, kyjevského, vladimírskeho, novgorodského, astrachánskeho, kazanského, poľského a sibírskeho, veľkovojvodu litovského, volynského, podolského a fínskeho – ako znel oficiálny titul ruského imperátora – sa stali 75 rokov po jeho násilnej smrti predmetom vedeckého záujmu. Dôvodom tohto záujmu bola práve jeho násilná smrť a nejasnosti okolo nej.

Štúdium kostrových pozostatkov malo potvrdiť alebo vyvrátiť domnienku, že plytká pohrebná jama, ktorú objavili r. 1992 dvaja ruskí amatérski historici neďaleko Jekaterinburgu (bývalého Sverdlovska) na Strednom Urale, obsahuje pozostatky posledného ruského cára a jeho rodiny. Táto domnienka bola založená na informáciách o posledných dňoch života a o posmrtnom osude cárskej rodiny, ktoré sa zachovali vo veľmi skúpych, utajovaných a falšovaných historických prameňoch.

Kľúčovú úlohu zohrala analýza DNA, ktorú vykonal tím anglických a ruských molekulárnych genetikov. Chceme ukázať – na príklade identifikácie členov cárskej rodiny – aké možnosti poskytuje analýza DNA pri identifikácii osôb a ako to vyzerá s možnosťou získavať a študovať DNA z kostrových pozostatkov.

Historické pozadie

V júli 1918 boli – na priamy príkaz z najvyšších sfér boľševickej moci – popravení v Jekaterinburgu členovia poslednej ruskej cárskej rodiny Romanovcov: cár Mikuláš II. (ktorý abdikoval už v marci 1917), jeho manželka cárovná Alexandra, ich štyri dcéry, Mária, Tatiana, Oľga a Anastázia, i jediný syn, pôvodne následník trónu, cárovič Alexej. Spolu s niekoľkými členmi služobníctva a rodinným lekárom ich postrieľala popravčia čata, ktorá potom časť tiel zakopala do spoločného hrobu. Hrob a pozostatky sa nikdy nenašli, čo vyvolalo rad dohadov o osude cárskej rodiny a umožnilo niekoľkým podnikavcom vydávať sa za jej členov.

Keď sa r. 1992 našla už zmieneným spôsobom pohrebná jama s väčším množstvom ľudských kostí, nariadil ruský generálny prokurátor ich súdno-lekárske vyšetrenie, na ktorom sa ako experti na analýzu DNA zúčastnili Peter Gill, vedúci príslušného laboratória Ústavu súdneho lekárstva v Readingu (Veľká Británia), a P. L. Ivanov z Engelhardtovho ústavu molekulárnej biológie Ruskej akadémie vied v Moskve.

Ešte predtým však ruskí súdni lekári a anatropológovia preskúmali nález klasickými metódami a ich závery silne podporili domnienku, že ide o hľadané pozostatky. Hoci kostry boli veľmi poškodené (zámerne), určili ich počet, vek a pravdepodobné pohlavie, našli v nich niekoľko projektilov a u niektorých zlatú a platinovú zubnú výplň: dôkaz, že muselo ísť o telesné pozostatky príslušníkov vysokej šľachty. Hrob obsahoval dovedna deväť kostier, no len tri z nich boli detské: dve cárske deti teda neboli pochované v spoločnom hrobe.

Analýza DNA z kostí jekaterinburského nálezu mala tri ciele:

• určiť pohlavie jednotlivých kostier;
• určiť, ktoré z nájdených kostier môžu patriť vzájomne príbuzným jedincom, t. j. môžu predstavovať cársku rodinu, a ktoré nepríbuzným jedincom – príslušníkom služobníctva;
• porovnaním s DNA žijúcich príbuzných zavraždených Romanovcov potvrdiť autentickosť nálezu.

DNA v starobylých tkanivách

DNA je prekvapujúco stabilná makromolekula. Vo vhodných podmienkach sa môže zachovať v pomerne neporušenom stave mimoriadne dlho. Pravda, takéto vhodné podmienky nastávajú v prírode len výnimočne (1). Údaje o úspešnej izolácii fragmentov DNA z objektov starých milióny až stovky miliónov rokov síce nie sú veľmi presvedčivé (a mnohí odborníci ich spochybňujú), no údaje o izolácii DNA z tkanív starých tisíce až desaťtisíce rokov sú nespochybniteľné. Zväčša to však nie sú kosti, ale prirodzene, či umelo mumifikované mäkké tkanivá (napr. zo staroegyptských múmií), tkanivá konzervované v ľade (napr. z ötzalského nálezu v Alpách, ale aj z permafrostom konzervovaných zvyškov mamuta) alebo tkanivá vysušené, prípadne náhodne zaliate do prírodného konzervačného činidla (napr. jantáru).

Ľudské kosti pochované v zemi sú vo všeobecnosti zlým zdrojom DNA. Už po niekoľkých desaťročiach, nanajvýš storočiach je prakticky všetka DNA degradovaná a chemicky pozmenená; len ojedinele sa podarí izolovať krátke fragmenty. Pozostatky Romanovcov ležali v zemi takmer 75 rokov, takže úspech sa nedal vopred zaručiť.

Základný krok: PCR

Keďže výťažky DNA z takýchto starých tkanív bývajú nepatrné a DNA je vždy silno degradovaná, rozlámaná na krátke kúsky, cesta k jej úspešnej analýze vedie cez polymerázovú reťazovú reakciu, PCR. O PCR, tomto metodickom zázraku súčasnej molekulárnej genetiky, sa písalo vo Vesmíre už viac ráz (2). Jednako, stručná rekapitulácia princípu tejto supermetódy azda nie je zbytočná:

PCR je enzymatická reakcia, ktorá umožňuje namnožiť špecifický, vopred definovaný úsek DNA na prakticky ľubovoľný počet kópií. Musíme však poznať sekvencie báz na začiatku a na konci tohto úseku, jeho dĺžka nesmie presiahnuť tisíce bázových párov a v analyzovanej vzorke DNA sa tento úsek musí nachádzať aspoň v jednej neporušenej kópii. Ak vzorka pochádza zo starobylého zdroja, je len malá nádej, že by sa v nej našiel neporušený úsek dlhý tisíce bázových párov, ale pri troche šťastia sa nájdu úseky dlhé desiatky bázových párov. Keď ich metódou PCR namnožíme – amplifikujeme – sprístupníme ich ďalšiemu štúdiu.

DNA a pohlavie

Metóda PCR umožňuje určiť pohlavie pôvodcu vzorky DNA viacerými spôsobmi. Technicky najjednoduchšie je uskutočniť amplifikáciu niektorého úseku DNA, ktorý je špecifický pre ľudský Y-chromozóm. Keďže tento chromozóm majú len muži, pozitívny výsledok samozrejme značí, že analyzovaná vzorka je mužská. Lenže negatívny výsledok nemusí nevyhnutne indikovať ženu: možno analyzovaná DNA vôbec nie je ľudská, možno je chemicky modifikovaná, možno sa amplifikácia jednoducho nepodarila.

Autori preto použili postup zabezpečujúci vnútornú kontrolu úspešnosti amplifikácie. Využili skutočnosť, že gén, ktorý kóduje významnú bielkovinu zubnej skloviny amelogenín a leží na chromozóme X, má na chromozóme Y nefunkčnú kópiu. Tá sa od funkčného génu líši tým, že má jeden úsek o 6 bázových párov (bp) dlhší: dosahuje dĺžku 112 bp, kým na X-chromozómovom géne len 106 bp. Z mužskej DNA sa naamplifikujú dva úseky (106 bp aj 112 bp), zo ženskej len jeden (106 bp), pretože muž má chromozómy X aj Y, kým žena len dva X.

Sex-test, založený na detekcii tohto úseku je spoľahlivý, jednoduchý a citlivý, rutinne sa využíva napr. v kriminalistickej praxi pri určovaní pohlavia pôvodcov krvavých stôp alebo v medicíne pri prenatálnej diagnostike pohlavia.

Test určil ako ženskú len jednu z dospelých kostier – tú, ktorú antropologická expertíza identifikovala ako pravdepodobnú cárovnú – a všetky tri detské kostry: žiadna teda nemohla patriť cárovičovi Alexejovi.

Rodinná skladačka

Na zisťovanie príbuzenských vzťahov sú obzvlášť vhodné také úseky DNA, v ktorých je medzi ľuďmi veľká variabilita, takže nepríbuzní jedinci sa v nich s vysokou pravdepodobnosťou navzájom odlišujú. Navyše to musia byť – v našom prípade – úseky pomerne krátke, aby bola šanca, že sa nájdu aj v čiastočne degradovanej DNA a bude ich možno amplifikovať pomocou PCR.

Tieto podmienky výborne spĺňajú tzv. mikrosatelity, označované aj skratkou STR (z angl. short tandem repeats – krátke tandemové opakovania). Sú to úseky DNA, v ktorých sa nachádza určitý krátky sekvenčný motív – napr. sekvencia štyroch báz AATG – u rôznych jedincov v rozličnom počte tesne za sebou uložených opakovaní (obrázek). Počet opakovaní tejto štvorice môže kolísať, napr. od 10 do 30, čiže dĺžka úseku vtedy kolíše od 4 x 10 = 40 do 4 x 30 = 120 bp. Keďže každý človek má dva chromozómy s týmto špecifickým STR, môže mať dva úseky (tzv. alely) rozličných dĺžok: to vtedy, ak od každého rodiča zdedil chromozóm s iným počtom opakovaní príslušnej štvorice. Ak zdedil od obidvoch rodičov chromozóm s rovnakým počtom opakovaní, nájdeme v jeho DNA tento úsek len v jednom dĺžkovom variante.

Dĺžka fragmentu DNA sa nemeria pod elektrónovým mikroskopom (bežná laická predstava), ale sa určuje nepriamo. Využíva sa tzv. gélová elektroforéza, založená na skutočnosti, že vo vhodnom géli, ktorým prechádza jednosmerný prúd, fragmenty DNA migrujú. Rýchlosť pohybu závisí od ich dĺžky: čím sú kratšie, tým rýchlejšie sa pohybujú, t. j. tým ďalej od štartu ich nájdeme po skončení elektroforézy. Po zafarbení sa javia v géli ako pruhy, ktorých poloha (vzdialenosť od štartu) priamo informuje o dĺžke príslušných fragmentov.

Odhaduje sa, že v ľudskom genóme sa nachádza približne toľko mikrosatelitov, koľko je v ňom génov, t.j. 50 až 100 tisíc. Hoci sú také hojné, ich funkciu – ak vôbec nejakú majú – zatiaľ nepoznáme. Napriek tomu ich mnohostranne využívame, predovšetkým ako markery pri triangulácii ľudskej génovej mapy. Vyše 4000 špecifických mikrosatelitov je už presne lokalizovaných v génovej mape, takže vytvárajú systém vzťažných bodov, akúsi sieť, do ktorej sa zaraďujú novoobjavené gény alebo iné dôležité úseky DNA. Niektoré z mikrosatelitov sú mimoriadne variabilné a dajú sa veľmi jednoznačne detegovať. To – spolu s jednoduchým chodom dedičnosti – z nich robí výborných praktických pomocníkov pri najrozličnejších genetických aplikáciách.

Dedičnosť mikrosatelitov je jednoduchá: každý jedinec zdedí jeden úsek (t. j. jednu alelu) od matky, druhý od otca. Teda rodič a dieťa musia mať najmenej jednu rovnakú alelu a nikto nemôže mať alelu, ktorá sa nenachádza ani u jedného rodiča – ak pravda odhliadneme od veľmi zriedkavej možnosti mutácie. Tieto vlastnosti priam predurčujú mikrosatelity na použitie pri určovaní sporného otcovstva, ako ilustruje obrázek.

Na rovnakom princípe je založená aj identifikácia príbuzenských vzťahov medzi jedincami, ktorých kostry sa našli v jekaterinburskom hrobe. Na obrázku je schematicky znázornený výsledok vyšetrenia jedného z mikrosatelitov u všetkých deviatich kostier.

Jedinec č. 7 je žena; ak je matkou detí č. 4, 5 a 6, tie od nej museli zdediť alelu 8, pretože ona inú alelu nemá. Deti majú navyše alely 7 a 10, takže ako ich možný otec prichádza do úvahy výlučne jedinec č. 3, lebo iba v jeho DNA sú obidve tieto alely.

Aj skladačka z ostatných vyšetrených mikrosatelitov – dovedna ich autori vyšetrili päť – podporuje záver, že jedinci č. 3 až 7 tvoria rodinu. V skutočnosti je prakticky vylúčené, že by mohlo ísť o kostry vzájomne nepríbuzných jedincov, pretože v takom prípade by bolo rodičovstvo takmer určite vylúčené vyšetrením aspoň jedného z piatich skúmaných mikrosatelitov. Rodinu teda poznáme: sú to však Romanovci?

Kráľovská genealógia a mitochondriálna DNA

Je všeobecne známe, že následník trónu cárovič Alexej trpel ťažkou formou vrodenej krvácavosti, hemofílie. Toto genetické ochorenie zapríčiňuje mutácia génu ležiaceho na chromozóme X: muži s mutáciou sú postihnutí, ženy sú zdravé prenášačky, pretože okrem X-chromozómu s mutáciou majú ešte ďalší X-chromozóm zabezpečujúci normálnu funkciu (3).

Alexej zdedil mutáciu od svojej matky. Cárovná Alexandra Fiodorovna, pred svojím vydajom hessensko-darmstadská princezná Alix Victoria, bola vnučkou anglickej kráľovnej Viktórie, po ktorej nezdedila len slávne meno, ale aj hemofilickú mutáciu: na hemofíliu zomrel jej brat a viacerí vzdialenejší mužskí príbuzní. Gén, ktorého mutácia zapríčiňuje hemofíliu, bol už dávnejšie úspešne klonovaný a je veľmi dobre preštudovaný. Podarilo sa na ňom identifikovať celé spektrum najrozličnejších mutácií a postupne sa objasňuje, ako jednotlivé mutácie súvisia so stupňom klinickej závažnosti ochorenia. Prenatálna diagnóza hemofílie na základe analýzy DNA sa vykonáva už bezmála desať rokov a je už dlhšie zavedená aj v SR a ČR. Zdalo by sa teda, že pri identifikácii Romanovcov sa bude študovať gén zodpovedný za hemofíliu. To však znemožňuje jeho mimoriadna dĺžka: takmer 200 000 bázových párov. Navyše, kostra postihnutého cároviča sa v hrobe nenašla a u jeho matky prenášačky sa okrem mutovaného génu nachádza aj jeho normálna kópia, čo komplikuje analýzu.

Na potvrdenie genealogickej spojitosti so žijúcimi príbuznými zavraždených Romanovcov sa použil celkom iný prístup: analýza mitochondriálnej DNA (4). Mitochondriálna DNA (mtDNA) sa nachádza v každej bunke v mnohých tisícoch identických kópií, preto sa v kostrových pozostatkoch zachová skôr ako jadrová DNA, ktorá je v bunke len vo dvoch kópiách. Navyše, mitochondriálna DNA človeka je asi desaťkrát variabilnejšia ako jadrová: ak porovnáme DNA dvoch nepríbuzných ľudí, nájdeme medzi nimi na jednotku dĺžky v mitochondriálnej DNA asi 10krát viac odlišností ako v DNA jadrovej. No hlavná prednosť mitochondriálnej DNA pri štúdiu genealogických vzťahov spočíva v špecifickom spôsobe jej prenosu: kým z jadrovej DNA má každý jednu kópiu od matky a druhú od otca, mitochondriálnu DNA zdedí každý výlučne od svojej matky. MtDNA sa prenáša z generáciu na generáciu takpovediac po praslici – teda matrilineárne. Preto sa jej analýza nedá využiť pri určovaní sporného otcovstva, no výborne sa hodí na identifikáciu kostrových pozostatkov jedinca, ku ktorému máme porovnávací materiál od jeho matrilineárnych príbuzných.

Analýza mtDNA sa už veľakrát osvedčila pri identifikácii obetí vrážd; paradoxne však pomohla aj pri identifikácii kostrových pozostatkov najmasovejšieho vraha v histórii Josefa Mengeleho, ktorú nedávno uskutočnila skupina anglických odborníkov. Darí sa využívať ju i pri štúdiu historických a archeologických kostrových nálezov, a to i vyše 700 rokov starých.

Variabilita v mtDNA nie je dĺžková, ako pri mikrosatelitoch, ale sekvenčná. Pre účely identifikácie preto nestačí určiť dĺžku amplifikovaného úseku – tá je vždy rovnaká – ale treba určiť presnú sekvenciu jednotlivých báz.

Celá ľudská mtDNA je dlhá asi 16 000 bázových párov, ale pre účely identifikácie sa najčastejšie amplifikuje jej najvariabilnejší úsek, tzv. D-kľučka, ktorá je dlhá asi 1000 bp. Zistilo sa, že v sekvencii D-kľučky sa dvaja nepríbuzní ľudia navzájom odlišujú v priemere v siedmich až ôsmich bázach. Ak sú matrilineárne príbuzní, neodlišujú sa vôbec, pokiaľ náhodou v niektorej generácii, ktorá ich navzájom spája, nenastala v tomto úseku mutácia. To je síce nepravdepodobné, nie však vylúčené: tento úsek DNA je tzv. mutačným horúcim miestom – veď práve preto je v D-kľučke sekvenčná variabilita medzi ľuďmi taká vysoká.

Peter Gill a jeho spolupracovníci amplifikovali (po častiach) a sekvencovali takmer celú oblasť mitochondriálnej D-kľučky zo všetkých 9 exhumovaných kostier. Výsledok porovnania sekvencií je jednoznačný: predpokladaná cárovná sa úplne zhoduje so všetkými tromi deťmi, kým všetky ostatné porovnávané vzorky sa od nich odlišujú, a to v štyroch až siedmich bázach, a líšia sa aj navzájom.

Žijúcim matrilineárnym príbuzným cárovnej Alexandry je princ Filip, vojvoda z Edinburgu, manžel anglickej kráľovnej Alžbety II. Je vnukom cárovninej sestry Viktórie, teda cárovniným prasynovcom (obrázek). Porovnanie ukázalo, že sekvencia D-kľučky jeho mitochondriálnej DNA sa úplne zhoduje s nálezom z jekaterinburského hrobu: autentickosť pozostatkov cárovnej a detí je teda nepochybná. (Mimochodom: princ Filip i jeho manželka kráľovna Alžbeta II. sú obidvaja potomkami kráľovnej Viktórie, lenže Alžbeta po meči, Filip po praslici: Alžbeta preto zdedila kráľovskú korunu, kým Filip mitochondriálnu DNA.)

Trochu odlišná je situácia s autentickosťou kostry č. 3, ktorá by podľa ostatných okolností mala patriť cárovi. Tu sme svedkami drobnej genetickej kuriozity.

Cár Mikuláš II. má dvoch žijúcich matrilineárnych príbuzných, ktorých DNA bola k dispozícii na porovnanie, tí sú však od neho v rodokmeni vzdialení väčší počet generačných krokov. Je to jednak cárova pra-praneter, jednak pravnuk cárovej starej matky po praslici. Ich mtDNA sa síce navzájom zhoduje, no v jednej báze (z ca 800 porovnávaných báz) sa odlišuje od sekvencie, ktorá sa našla v DNA pozostatkov predpokladaného cára. Nepatrí teda kostra č. 3 Mikulášovi II.?

Na pozadí všetkých ostatných usvedčujúcich okolností, predovšetkým však na základe výsledkov analýzy mikrosatelitovej DNA je táto eventualita krajne nepravdepodobná. Oveľa pravdepodobnejšia sa javí možnosť, že práve v genealogickej línii medzi cárovou starou matkou a cárom nastala v tejto jedinej báze mutácia. Odhaduje sa, že v D-kľučke ľudskej mitochondriálnej DNA vznikajú mutácie najmenej 1000-krát častejšie ako v jadrovej DNA: približne jedna mutácia na bázu za 300 generácií. Nie je to síce veľa, ale autori rozboru cárskej DNA vypočítali, že pravdepodobnosť mutácie je mnohonásobne vyššia než pravdepodobnosť, že kostra č. 3 patrí nepríbuznému jedincovi, ktorého však náhodou ani jeden z vyšetrených mikrosatelitov nevylúčil z otcovstva voči cárovym deťom. Taká obrovská je identifikačná sila analýzy variability mikrosatelitov.

Keď sa anglický kráľovský pár pri svojej vlaňajšej návšteve Ruska sklonil nad miestom posledného odpočinku nešťastnej cárskej rodiny, mal teda úplnú istotu, že sú tam skutočne uložené pozostatky ich príbuzných, cárovnej Alexandry s deťmi a jej manžela, posledného vládcu Ruska, cára moskovského, kyjevského a vladimírskeho...